【佳學(xué)基因檢測(cè)】采用外顯子測(cè)序基因檢測(cè)明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病

遺傳病、罕見病基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的特征是手腳遠(yuǎn)端區(qū)域的攣縮。嚴(yán)重的類型是遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲2A 型（也稱為 Freeman-Sheldon 綜合征）和 2B 型（也稱為 Sheldon-Hall 綜合征），會(huì)出現(xiàn)面部受累和脊柱側(cè)凸，而 AMCD1 (DA1) 則沒有。AMCD1又叫做1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮，影響大約萬分之一的兒童，是最常見的類型型。

肌節(jié)中編碼蛋白質(zhì)的多個(gè)基因，包括肌球蛋白重鏈 3 (MYH3)、肌球蛋白重鏈 8 (MYH8)、原肌球蛋白 2 (TPM2)、肌鈣蛋白 I2 (TNNI2)、肌鈣蛋白 T3 (TNNT3) 和肌球蛋白結(jié)合蛋白 C1 (MYBPC1) )，與遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲綜合征有關(guān)。盡管 MYH3 突變導(dǎo)致幾乎所有 Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）病例和近三分之一的 Sheldon-Hall 綜合征（2B 型）病例，但根據(jù)佳學(xué)基因檢測(cè)的記錄，MYH3 突變尚未在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲類型1的患者中發(fā)現(xiàn)。先前的基因檢測(cè)記錄表明，已知的 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的基因突變很少，因此，基因解碼認(rèn)為這一疾病存在遺傳異質(zhì)性，并且仍有待確定其他致病基因。

由于涉及遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲綜合征的基因數(shù)量眾多且相對(duì)較大，因此需要對(duì)所有基因進(jìn)行測(cè)序的新方法，以有效地確定個(gè)體家族中遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的遺傳基礎(chǔ)。外顯子組測(cè)序是一種新的基因測(cè)序工具，它使用下一代測(cè)序方法來識(shí)別整個(gè)人類基因組（“外顯子組”）編碼外顯子內(nèi)的突變。由于外顯子組僅占基因組的 1%，因此目前僅對(duì)外顯子進(jìn)行測(cè)序的成本只是全基因組測(cè)序成本的一小部分。

佳學(xué)基因的致病基因鑒定基因解碼采用的是基于全外顯子測(cè)序的結(jié)構(gòu)功能分析法。其中的全外顯子組測(cè)序使用的是下一代外顯子組捕獲測(cè)序方法，代表了致病基因鑒定方法的重大進(jìn)步，盡管存在局限性，但這些方法可能很快會(huì)對(duì)遺傳性肌肉骨骼疾病患者的診斷產(chǎn)生重大影響。例如，在本例中描述的家族中對(duì) MYH3 突變的鑒定擴(kuò)大了與 MYH3 突變相關(guān)的表型，包括 AMCD1，并表明 1、2A 和 2B 型之間可能存在大量重疊。孤立性馬蹄內(nèi)翻足的鑒別診斷應(yīng)考慮 AMCD1，特別是在患者或家庭成員存在輕微手部攣縮的情況下。

采用外顯子測(cè)序基因檢測(cè)明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病材料和方法

DNA 是從一個(gè)家族的所有受影響和幾個(gè)未受影響的成員利用抗凝EDTA采血管采集的靜脈血。該家族包括 6 名 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥患者。使用 SureSelect All Exon 38Mb 試劑盒（Agilent Technologies）對(duì)其中一名受影響的家庭成員（先證者）進(jìn)行外顯子組捕獲）。在 HiSeq 2000 測(cè)序儀（Illumina，San Diego，California）的單通道上對(duì) DNA 進(jìn)行測(cè)序。使用 Novoalign 軟件（Novocraft Technologies，Selangor，Malaysia）將序列與基因組的 hg18 組裝比對(duì)，并使用 SAMtools 和 SeattleSeq識(shí)別突變的基因序列。在分析時(shí)，僅包含至少六倍讀取覆蓋率和 Phred 標(biāo)度單核苷酸多態(tài)性質(zhì)量≥30 的變體用于進(jìn)一步分析。存在于 1000 基因組計(jì)劃 ( http://www.1000genomes.org )、dbSNP（build 129）或20名無關(guān)疾病患者的內(nèi)部外顯子組數(shù)據(jù)庫中的變異已被刪除. 使用 ABI 3730 測(cè)序儀（Life Technologies，Carlsbad，California）通過 Sanger 測(cè)序?qū)λx的突變進(jìn)行驗(yàn)證。

假設(shè) 80% 的外顯率和 0.1% 的頻率導(dǎo)致疾病的等位基因，使用來自六個(gè)受影響和六個(gè)未受影響的家庭成員的陣列基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析。基因分型佳學(xué)基因使用使用 Mapping 10K XbaI 陣列進(jìn)行。然后進(jìn)行進(jìn)行連鎖分析。

采用外顯子測(cè)序基因檢測(cè)明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病結(jié)果

一個(gè)多代家庭出現(xiàn)不有效外顯性、常染色體顯性遺傳的 AMCD1，其特征是馬蹄內(nèi)翻足和輕度手部攣縮。5 位家庭成員患有馬蹄內(nèi)翻足，其中 4 人為雙側(cè)，1 人為單側(cè)（圖 1A)。患有單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足的先證者（家譜中鑒定為 III:3）采用 Ponseti 方法（圖 1B) 但有兩次反復(fù)，需要重復(fù)跟腱切斷術(shù)以保持矯正。其他患有馬蹄內(nèi)翻足的家庭成員接受了廣泛的軟組織松解治療。兩名患有馬蹄內(nèi)翻足的家庭成員（個(gè)體 II:7 和 II:9）也有輕度手部攣縮，主要累及遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)（圖 1C和D)。此外，一名家庭成員（個(gè)人 II:1）在青春期出現(xiàn)遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)攣縮，但沒有馬蹄內(nèi)翻足或其他下肢受累。先證者和其他僅表現(xiàn)出馬蹄內(nèi)翻足的個(gè)體沒有手部受累的其他跡象，包括沒有屈曲折痕、壓倒手指和拇指近端。由于沒有面部受累，因此診斷為 AMCD1。

圖1：1型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥家族成員的遠(yuǎn)端肢體攣縮。A：先證者的腳（鑒定為III:3 in圖 2), 顯示左腳單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足。B：使用 Ponseti 方法矯正馬蹄內(nèi)翻足后先證者的腳，在 7 歲時(shí)顯示出有限的殘余畸形。C：先證者阿姨的近端拇指和遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)攣縮（確定為 II:7 in圖 2). D：先證者父親的彎曲指畸形（鑒定為 II:9 in圖 2).

肌球蛋白結(jié)合蛋白 C1 (MYBPC1) 的測(cè)序是一種最近與 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的某些病例有關(guān)的基因，未發(fā)現(xiàn)任何致病突變。然而，由于幾乎沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 AMCD1的基因，AMCD1致病基因鑒定基因解碼在對(duì)先證者的 DNA 進(jìn)行了基于外顯子組測(cè)序基因檢測(cè)的基因解碼過程。

對(duì) Illumina HiSeq 配對(duì)末端序列的單個(gè)通道的分析產(chǎn)生了 142,366,935 個(gè)讀數(shù)，其中 93% 可以與人類基因組對(duì)齊。這在 6× 的最小測(cè)序深度下提供了 93% 的序列覆蓋率。使用這種方法，在先證者的外顯子組中識(shí)別出總共 24,323 個(gè)會(huì)導(dǎo)致非同義氨基酸取代、剪接位點(diǎn)變異、插入或缺失的變異。在排除對(duì)照數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率 >5% 的變體后，仍然存在 524 個(gè)單核苷酸基因序列突變和 49 個(gè)插入缺失（插入或缺失）。

這 573 個(gè)基因突變序列中的一個(gè)由 MYH3 中的錯(cuò)義突變組成，MYH3 是一種胚胎肌球蛋白重鏈基因，之前曾與 2A 型和 2B 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲有關(guān)。Sanger 測(cè)序證實(shí)了所有患有馬蹄內(nèi)翻足的個(gè)體以及患有青春期手部攣縮癥的個(gè)體都存在 MYH3 F437I 突變（圖 2). chr17:10488494 (hg18) 處的 A→T 錯(cuò)義突變導(dǎo)致氨基酸異亮氨酸取代殘基 437 處的苯丙氨酸。該殘基位于肌球蛋白頭部?jī)?nèi)，在多個(gè)物種中高度保守 (圖 3)，但它位于 ATP 結(jié)合槽之外，突變似乎會(huì)導(dǎo)致最嚴(yán)重的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲，即 Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）（圖 4) 。PolyPhen-2 程序以 99.7% 的置信度預(yù)測(cè)這種突變“可能具有破壞性”。

圖 2：該家族的系譜，顯示有和沒有 AMCD1的成員。黑色陰影表示馬蹄內(nèi)翻足，星號(hào)表示手部攣縮。MYH3 F437I 突變的存在用“Mut”表示，不存在用“WT”表示。

圖 3：多個(gè)物種序列中與 F437I 突變對(duì)應(yīng)的位置周圍的 MYH3 氨基酸比對(duì)。殘基 437 處的苯丙氨酸由矩形表示，并且在所示的所有物種中都是保守的，包括小鼠、大鼠、人、牛、青蛙和雞。使用 CLUSTALW 程序 ( http://align.genome.jp ) 對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。

圖 4：包含氨基酸 4 到 1022 的 MYH3 S2（肌球蛋白頭）區(qū)域的帶狀圖。在具有 AMCD1的家族中鑒定的 MYH3 F437I 突變的位置以橙色顯示。導(dǎo)致 2A 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲（Freeman-Sheldon 綜合征）的其他五個(gè)已知突變的位置以紅色顯示；其中四個(gè)位于肌球蛋白頭部并位于形成 ATP 結(jié)合位點(diǎn)凹槽中。該圖像由 Swiss-PDBViewer (DeepView) 程序 ( http://ca.expasy.org/spdbv ) 為蛋白質(zhì)登錄號(hào)P11055 (MYH3)生成。

為了確認(rèn)此 MYH3 F437I 突變的重要性，使用來自該家族所有六個(gè)受影響個(gè)體的 Affymetrix 10K 單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行了連鎖分析。最大的 LOD（對(duì)數(shù)比值）得分為 1.86，位于包含 MYH3 基因的 17p 號(hào)染色體上（圖 5), 而 MYH3 突變是唯一位于大約 3 Mb 連鎖區(qū)間內(nèi)的外顯子組變異。其他不太重要的連鎖區(qū)間均不包含任何其他罕見變體。

圖 5：1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥與染色體 17p 的聯(lián)系。從 Affymetrix 10K 陣列數(shù)據(jù)構(gòu)建的 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥家族的參數(shù)化多點(diǎn) LOD（幾率的對(duì)數(shù)）分?jǐn)?shù)的全基因組概況。從 p 端（左）到 q 端（右）的人類染色體在水平軸上連接在一起。垂直軸顯示了水平軸上指示的人類染色體上物理位置的參數(shù) LOD 分?jǐn)?shù)。1.86 的峰值 LOD (pLOD) 得分（定義最強(qiáng)的連鎖區(qū)域）位于染色體 17p 內(nèi)。

采用外顯子測(cè)序基因檢測(cè)明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病材料和方法討論

我們的結(jié)果表明，MYH3 突變可能與 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥（以及如前所述的 2A 和 2B 型4）相關(guān)。所有類型的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲都以家族之間和家族內(nèi)廣泛的表型變異為特征1，我們的數(shù)據(jù)表明，遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲 1 型與 2A 和 2B 型也可能存在臨床和遺傳重疊。需要考慮基因型和表型的這些綜合征的未來分類系統(tǒng)。

將 MYH3 鑒定為該 AMCD1家族中致病突變的位置得到了該基因與 2A 型和 2B 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的已知關(guān)聯(lián)的支持，這些疾病與 AMCD1密切相關(guān)，并且通過預(yù)測(cè) F437I 突變會(huì)破壞蛋白質(zhì)的功能。此外，殘基 437 處的苯丙氨酸在許多哺乳動(dòng)物物種中高度保守，并且未在任何對(duì)照中發(fā)現(xiàn)突變。最值得注意的是，所有受影響的家庭成員中 MYH3 F437I 突變的分離增加了我們對(duì)正確識(shí)別致病突變的信心。對(duì)其他家族成員的變異測(cè)序仍然是有用的，如果不是關(guān)鍵的話，

正如 Toydemir 等人所建議的，MYH3 突變的位置可能與遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的嚴(yán)重程度相關(guān)。在所有受影響的家庭成員中，遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的持續(xù)輕微表型進(jìn)一步支持了涉及 MYH3 的疾病的基因型-表型相關(guān)性。F437I 突變略微位于 ATP 結(jié)合溝外，導(dǎo)致最嚴(yán)重形式的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲、Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）的突變位于. 然而，由于缺乏方便的檢測(cè)方法，了解可能改變骨骼肌收縮力（通過影響核苷酸結(jié)合、ATP 催化或與肌動(dòng)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的相互作用）的 MYH3 錯(cuò)義突變的生理影響一直受到阻礙。需要進(jìn)一步研究以更好地了解這些突變?nèi)绾螌?dǎo)致疾病。

本研究中描述的家庭還表明，將 AMCD1確定為孤立性馬蹄內(nèi)翻足的原因偶爾會(huì)遇到困難。盡管該家族中有 3 人患有孤立性馬蹄內(nèi)翻足，但即使有 1 名家族成員存在手部攣縮，也應(yīng)表明存在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的可能性。然而，手部攣縮可能要到青春期才會(huì)出現(xiàn)，正如在具有 MYH3 F437I 突變的個(gè)體 II:1 中所證明的那樣。雖然如果不使用適當(dāng)?shù)闹委煟ɡ缰Ь撸┛赡軙?huì)導(dǎo)致攣縮惡化，但通常認(rèn)為攣縮在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的病例中是非進(jìn)展性的. 遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥中攣縮的非進(jìn)行性且通常是先天性的性質(zhì)歸因于基因缺陷的位置，例如 MYH3，據(jù)信這些基因僅在胎兒發(fā)育期間表達(dá)。然而，最近的研究表明，MYH3 也在成人肌肉中表達(dá)，也許可以解釋這個(gè)家族中一名成員的遲發(fā)性手部攣縮。在高度外顯性、常染色體顯性馬蹄內(nèi)翻足家族的鑒別診斷中也應(yīng)考慮遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲，因?yàn)檫@種遺傳模式在孤立的馬蹄內(nèi)翻足中相對(duì)罕見，除了與反復(fù)性染色體 17q23 微缺失和微復(fù)制相關(guān)的馬蹄內(nèi)翻足外，大約導(dǎo)致所有家族性馬蹄內(nèi)翻足病例的 5%。對(duì)治療有抵抗力的馬蹄內(nèi)翻足也應(yīng)該提示遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的可能性。盡管先證者的馬蹄內(nèi)翻足使用 Ponseti 方法進(jìn)行了非手術(shù)治療，她出現(xiàn)了多次反復(fù)。盡管存在這些并發(fā)癥，但使用 Ponseti 方法治療遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的患者仍有可能獲得良好的結(jié)果。

這項(xiàng)研究的結(jié)果證明了新的測(cè)序方法在診斷人類肌肉骨骼疾病方面的能力。雖然本研究中患者的外顯子組測(cè)序是在研究基礎(chǔ)上進(jìn)行的，但臨床可用的診斷測(cè)試將很快利用類似的方法來篩選大基因組以尋找與疾病相關(guān)的突變。出于多種原因，外顯子組分析是識(shí)別致病突變的合理方法。首先，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)致病突變都位于基因的編碼區(qū)（外顯子組）內(nèi)，盡管這種情況在未來可能會(huì)發(fā)生變化，因?yàn)檠芯咳藛T現(xiàn)在正在發(fā)現(xiàn)不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域的范圍會(huì)影響人類健康和疾病. 其次，由于外顯子組僅占基因組的 1%，因此目前對(duì)外顯子組測(cè)序的成本只是全基因組測(cè)序成本的一小部分。最后，外顯子組分析不如整個(gè)基因組分析復(fù)雜，因?yàn)榭梢允褂贸墒斓姆椒▉眍A(yù)測(cè)或通過實(shí)驗(yàn)測(cè)試突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。

外顯子編碼變異的解釋雖然比全基因組序列分析結(jié)果的解釋簡(jiǎn)單，但仍然很復(fù)雜。外顯子組數(shù)據(jù)的分析在很大程度上依賴于使用過濾方法來排除一些健康（對(duì)照）個(gè)體中也存在的變異。這些正常變異是通過 1000 人基因組計(jì)劃的努力編制的，該計(jì)劃的目標(biāo)是在來自不同人群的 1000 多名健康個(gè)體中識(shí)別罕見變異. 然而，此類“對(duì)照”數(shù)據(jù)庫可能包括具有低外顯率的致病突變以及導(dǎo)致遲發(fā)性疾病的突變，這些突變尚未在提供對(duì)照樣本的據(jù)報(bào)道正常個(gè)體中表現(xiàn)出來。人類基因突變數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中的致病變異集合也將有助于分析外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)，但該數(shù)據(jù)庫目前僅列出了 13 個(gè) MYH3 突變. 由于導(dǎo)致遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲等罕見疾病的突變可能僅在單個(gè)家族中發(fā)現(xiàn)，因此此類數(shù)據(jù)庫目前在外顯子組分析中的用途可能有限。然而，最終，它們可能會(huì)充滿已知與特定疾病相關(guān)的高度可信的變體。最后，算法可用于預(yù)測(cè)修飾蛋白質(zhì)的基因突變的功能影響。然而，許多與疾病相關(guān)的突變，包括先前描述的人類肌球蛋白重鏈基因、中的幾個(gè)突變，被 PolyPhen-2 等程序錯(cuò)誤地預(yù)測(cè)為“良性”突變，從而限制了此類分析的整體用途.

盡管外顯子組測(cè)序存在局限性，例如難以將致病變異與已識(shí)別的大量其他新變異區(qū)分開來，但我們預(yù)計(jì)這些技術(shù)將迅速推進(jìn)醫(yī)學(xué)研究并有效改變患者護(hù)理。正如此處 MYH3 所證明的那樣，隨著外顯子組測(cè)序技術(shù)識(shí)別在相關(guān)疾病患者中也發(fā)現(xiàn)的突變，疾病相關(guān)基因變異逐漸被證明是導(dǎo)致表型范圍擴(kuò)大的原因。盡管 MYH3 突變是導(dǎo)致孤立性馬蹄內(nèi)翻足的罕見原因，當(dāng)任何家庭成員出現(xiàn)手部攣縮（即使是青春期出現(xiàn)的攣縮）或馬蹄內(nèi)翻足嚴(yán)重且難以治療時(shí)，應(yīng)考慮遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的診斷。盡管 MYH3 測(cè)序目前可作為單基因基因檢測(cè)，但我們預(yù)計(jì)擴(kuò)展基因組或基于外顯子組的測(cè)序?qū)⒑芸炜捎糜诩∪夤趋兰膊?，如遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲。

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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