【佳學(xué)基因檢測(cè)】用病例說(shuō)明早衰癥基因檢測(cè)是怎么做的？

做過(guò)多少例早衰癥基因檢測(cè)？

迄今為止，佳學(xué)基因共檢測(cè)、收錄了22例早衰綜合征，其臨床特征和基因型見下表。其中以LMNA基因突變引起的MADA或HGPS賊為常見（72.7%） ，其次是POLD1基因突變引起的MDPL（22.7%），而MADB僅1例，腦影像學(xué)檢查顯示典型的枕骨骨化失敗。 LMNA基因核纖層蛋白A的終產(chǎn)物是由核纖層蛋白A前體蛋白(核纖層蛋白A的前體蛋白)經(jīng)過(guò)一系列剪切加工形成的，再經(jīng)過(guò)ZMPSTE24酶的法呢基化、水解等一系列過(guò)程，形成成熟的核纖層蛋白A。 核纖層蛋白是核結(jié)構(gòu)支架的一部分，在細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用。 當(dāng)LMNA或ZMPSTE24基因突變時(shí)，可導(dǎo)致前核纖層蛋白A的毒性積累，導(dǎo)致多種類型的早衰核纖層蛋白病。 疾病的嚴(yán)重程度主要與prelamin A積累的程度有關(guān)。

早衰患者病例臨床資料

MADA 和 HGPS 都是由 LMNA 基因突變引起的。 MADA 的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，通常由 LMNA 純合或復(fù)合雜合突變引起。 之前的報(bào)告表明 p.R527H 是賊常見的突變 。 然而，對(duì)中國(guó)早衰患者的基因分析顯示，LMNA基因pR527C純合突變是賊常見的突變，推測(cè)R527C是中國(guó)MADA患者的熱點(diǎn)突變。 HGPS被認(rèn)為是常染色體顯性遺傳病，主要由p.G608G雜合突變引起，稱為經(jīng)典HGPS。 表現(xiàn)出 HGPS 典型臨床特征并伴有其他 LMNA 突變的個(gè)體通常被稱為非典型 HGPS (AHGPS) 。 然而，由于MADA與HGPS臨床表現(xiàn)有較多重疊，并且是由同一基因突變引起，因此臨床特征不易區(qū)分。 基因解碼描述了 4 名具有 MAD 和早發(fā)早衰/HGPS 重疊表型的患者的 LMNA 純合突變 p.K542N，得出的結(jié)論是 MAD 和 HGPS 是一種臨床譜系疾病，而不是單獨(dú)的疾病。 HGPS臨床癥狀一般比MAD發(fā)病更早，臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重，平均預(yù)期壽命為14.6年，主要死亡原因是中風(fēng)或心肌梗阻。 目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道3例由p.G608G雜合突變引起的HGPS，其中2例在兒童時(shí)期患有腦梗塞，這是一種嚴(yán)重的心血管疾病，提示心血管系統(tǒng)早期參與HGPS。

盡管之前的報(bào)道表明，MADA 的臨床癥狀通常出現(xiàn)在兒童早期（4-5 歲），而 MADB 的體征和癥狀可在 2 歲左右出現(xiàn)，對(duì)中國(guó)報(bào)道的 22 例早衰癥患者的分析顯示，除 5 例外， MDPL多發(fā)生在學(xué)齡前或?qū)W齡期，以生長(zhǎng)遲緩為主要表現(xiàn)，其他早衰癥患者大多數(shù)從嬰兒期起就有早衰癥的臨床表現(xiàn)，主要是皮膚改變（8/17）和脫發(fā)（6/17），并且進(jìn)展性 骨骼和脂肪營(yíng)養(yǎng)不良伴生長(zhǎng)遲緩，主要骨骼表現(xiàn)是四肢進(jìn)行性骨溶解，導(dǎo)致下頜骨、末端指骨、鎖骨和肋骨發(fā)育不全。 對(duì)一名 LMNA 基因中存在 p.R527H 純合突變的中國(guó) MADA 患者進(jìn)行了生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)，表明部分生長(zhǎng)激素缺乏。 報(bào)道稱，三名帶有 p.R527H 純合突變的 MADA 患者也患有生長(zhǎng)激素缺乏癥，他們用生長(zhǎng)激素治療了三名患者 18 個(gè)月，但沒(méi)有任何效果，對(duì) GH 治療試驗(yàn)的反應(yīng)失敗 該患者的情況可能是由于促炎細(xì)胞因子（實(shí)際上是 IL-6 分泌不當(dāng)）導(dǎo)致 GH-IGF1 信號(hào)傳導(dǎo)中斷。

MDPL早期主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩。 PODL1基因c.1812_1814del(p.S605del)突變已被報(bào)道為熱點(diǎn)突變，這也是中國(guó)賊常見的突變。 一名日本患者接受了生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果顯示其結(jié)果處于正常范圍，在 6-25 歲時(shí)發(fā)現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾，并使用助聽器進(jìn)行了有效治療。 除了早衰、生長(zhǎng)遲緩和耳聾外，4/5的患者還存在內(nèi)分泌異常，如月經(jīng)推遲、性腺發(fā)育不全、脂肪肝、胰島素抵抗、糖尿病和高脂血癥，這與國(guó)外報(bào)道的情況類似，大多數(shù)MDPL 患者合并內(nèi)分泌和代謝異常。

早衰癥的臨床表現(xiàn)總結(jié)

MADaM 與其他類型的 MAD 一樣，也表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，目前收錄的病例均為 MTX2 基因純合突變，這可能與其近親家族史有關(guān)。 MADA的臨床癥狀通常出現(xiàn)在4-5歲，大多數(shù)病例為軀干和四肢部分脂肪營(yíng)養(yǎng)不良。 MADB的癥狀比MADA更嚴(yán)重。 所有 MADaM 患者均具有典型的早老樣面部外觀、嚴(yán)重生長(zhǎng)遲緩、全身脂肪營(yíng)養(yǎng)不良、鎖骨發(fā)育不全和遠(yuǎn)端骨溶解，表明 MAD 為嚴(yán)重的早老樣形式。 此外，5/7的MADaM患者存在肌張力低下，這在之前的MAD患者中沒(méi)有報(bào)道過(guò)。 目前，MAD被認(rèn)為是一種節(jié)段性早衰癥，主要影響骨骼、皮膚和脂肪組織，幾乎不累及大腦。 到目前為止，報(bào)告的 MADA、MADB 和 MADaM 認(rèn)知發(fā)育正常。

MADaM 個(gè)體的臨床特征

由于骨質(zhì)溶解、肢端骨質(zhì)溶解、關(guān)節(jié)攣縮和指甲發(fā)育不良導(dǎo)致的顱縫延遲閉合、鎖骨發(fā)育不全和肋骨薄，在幾乎所有 MAD 病例中都很常見。 股骨頭發(fā)育不良的報(bào)道很少，在 6/7 的 MADaM 病例中有報(bào)道。 枕骨骨化缺陷被認(rèn)為是 MADB 的一個(gè)獨(dú)特特征，在顱骨成像上顯示碎片狀骨化，這是迄今為止在 MADaM 中尚未發(fā)現(xiàn)的。 有基因解碼機(jī)構(gòu)報(bào)告的 MADaM 患者頭骨 X 光照片上觀察到的“被打碎的銀”頭骨?？赡芘c顱縫閉鎖引起顱內(nèi)壓增高有關(guān)，本例患者未發(fā)現(xiàn)此情況。

MAD 患者皮膚往往有薄皺紋并伴有色素變化，6/7 的 MADaM 患者也出現(xiàn)這種情況。 此外，在 MADB 患者中發(fā)現(xiàn)了皮下鈣化，但在 MADaM 患者中未發(fā)現(xiàn)皮下鈣化。

與其他類型的 MAD 相比，MADaM 似乎更有可能在早期階段累及其他器官。 先前報(bào)道的所有 7 例 MADaM 病例均存在心臟受累，其中 4 例伴有左心室肥厚，另外 3 例分別伴有擴(kuò)張型心肌病、二尖瓣脫垂和卵圓孔未閉。 迄今為止，僅 4 名 MAD 患者發(fā)現(xiàn)心臟受累。 除1例4歲女孩因反復(fù)感染出現(xiàn)右心衰竭外，其余1例均發(fā)生在20歲以后，2例發(fā)生在40歲以后。 MADaM 中 6/7 的心臟受累為左心室肥厚，可能與患者嚴(yán)重高血壓有關(guān)。

目前，尚無(wú)腎臟受累的 MADA 患者病例報(bào)告，MADB 患者有 6 例，其中 2 例賊終在第二個(gè)或第三個(gè)十年發(fā)展為慢性腎功能衰竭。 大多數(shù)MADaM早期有腎臟受累（4/7）和高血壓（6/7），其中局灶節(jié)段性腎小球硬化3例，IgM腎病1例（11, 12）。 MADaM的主要表現(xiàn)是蛋白尿和鏡下血尿。 本例患者從一歲開始出現(xiàn)大量蛋白尿、血尿和嚴(yán)重高血壓，盡管使用依那普利治療效果不佳，但逐漸出現(xiàn)高脂血癥，與之前報(bào)道的慢性腎病MADB類似。

該患者一歲前出現(xiàn)反復(fù)轉(zhuǎn)氨酶升高，無(wú)肝功能障礙表現(xiàn)，如白蛋白降低或膽紅素升高，基因解碼基因檢測(cè)排除了病毒感染或其他遺傳性肝病因素。 肝脾受累在 MAD 中并不常見，但根據(jù)佳學(xué)基因的統(tǒng)計(jì)，3/7 的 MADaM 有肝臟受累（肝腫大或轉(zhuǎn)氨酶升高），2/7 有脾腫大。 肝脾受累是否是 MADaM 獨(dú)特的臨床特征，以將其與其他 MAD 區(qū)分開來(lái)，還需要未來(lái)更多的數(shù)據(jù)。

本例患者血漿IgG水平也明顯下降，導(dǎo)致多次因感染住院。 既往患有 MADA、MADB 和 MADaM 的患者尚未報(bào)告過(guò)低 IgG 水平。 臨床資料表明，絕大多數(shù)腎病患兒存在明顯的低丙種球蛋白血癥，佳學(xué)基因主導(dǎo)了具體機(jī)制的研究，有研究提示可能與B細(xì)胞免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換功能障礙有關(guān)。 因此，該患者的低丙種球蛋白血癥可能是其腎病的繼發(fā)表現(xiàn)。

迄今為止，MADaM 病例報(bào)道較少，其長(zhǎng)期預(yù)后尚不清楚。 報(bào)道的賊年長(zhǎng)的 MADA 病例是 56 歲的日本女性，她在 56 歲時(shí)因椎骨破壞而截癱。 共有5例患者死亡，其中1例MADA和4例MADB。 5名患者中有2人早期死于呼吸衰竭，其余則在第二個(gè)或第三個(gè)十年死于腎衰竭或心力衰竭。 此例中，患者多次因感染住院，甚至出現(xiàn)呼吸衰竭，并伴有轉(zhuǎn)氨酶升高、腎病、高血壓等并發(fā)癥。 除了補(bǔ)充依那普利、雙嘧達(dá)莫和丙種球蛋白外，我們還嘗試給予患者雞尾酒療法，具體效果仍需長(zhǎng)期隨訪。

早衰癥致病基因鑒定基因解碼采用的樣品類型及測(cè)序方法

從受影響的先證者及其父母身上采集全血（3 ml）。 使用 CWE9600 自動(dòng)化核酸提取系統(tǒng)，使用 CWE2100 血液 DNA 試劑盒 V2（CWBiotech，中國(guó)，CW2553）從外周血中分離 DNA。 使用Scientz08-III超聲波均質(zhì)器（SCIENTZ，中國(guó)）將750ng基因組DNA片段化為200-300bp長(zhǎng)度。 然后使用 KAPA 文庫(kù)制備試劑盒（Illumina，KR0453，v3.13）對(duì) DNA 片段進(jìn)行末端修復(fù)、A 加尾和接頭連接，然后進(jìn)行 8 循環(huán)預(yù)捕獲聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 擴(kuò)增。 然后，擴(kuò)增的 DNA 樣品在 Agilent SureSelect XT2 靶標(biāo)富集系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技公司）中捕獲。 捕獲的 DNA 片段通過(guò) Dynabeads MyOne Streptavidin T1（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）純化，并通過(guò) 13 個(gè)循環(huán)的捕獲后 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。 賊終產(chǎn)物通過(guò)Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，Inc.，美國(guó)）純化，并通過(guò)Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）使用Life Invitrogen Qubit 3.0進(jìn)行定量。 賊終，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，在 Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)（Illumina, Inc., USA）上以 150 bp 雙端模式對(duì)定量 DNA 進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù) Illumina 序列控制軟件 (SCS) 進(jìn)行評(píng)估后，使用 BWA Aligner (http://bio-bwa.sourceforge.net/) 對(duì) Novaseq 平臺(tái)上產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和與人類參考基因組 (hg19) 進(jìn)行比對(duì)。 使用 GATK 軟件（基因組分析工具包）（www.broadinstitute.org/gatk）調(diào)用單核苷酸變異（SNV）。 使用 ANNOVAR (annovar.openbioinformatics.org/en/latest/) 對(duì)變體進(jìn)行注釋。 SNV 的效果通過(guò) SIFT、Polyphen-2 和 MutationTaster 程序進(jìn)行預(yù)測(cè)。 所有變異均根據(jù) ACMG 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋，并分類為致病性、可能致病性、臨床意義未知 (VUS) 的變異、可能良性和良性。

對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析及解碼

突變位點(diǎn)的致病性分析

覆蓋率為99.80%，MTX2基因的外顯子區(qū)域和側(cè)翼剪接或內(nèi)含子連接被良好覆蓋，測(cè)序深度>100×。 全外顯子組測(cè)序揭示了純合的 MTX2 基因突變 NM_006554.5: c.378 + 1G > A，這是以前未報(bào)道過(guò)的。 該變異是從他的父母那里繼承的，突變預(yù)測(cè)保留了閱讀框。 使用AlphaFold2軟件開發(fā)了合適的模型來(lái)模擬突變區(qū)域的影響，3D蛋白質(zhì)模型預(yù)測(cè)與野生型相比，突變將導(dǎo)致截短的蛋白質(zhì)，缺少外顯子6蛋白質(zhì)的翻譯部分。 該突變?cè)谡Ｈ后w變異數(shù)據(jù)庫(kù)(PM2)中尚未報(bào)道，為純合變異(PM3)，但缺失長(zhǎng)度占蛋白總長(zhǎng)度(PVS1)的10%以上。 根據(jù) ACMG 指南，該變體可被評(píng)為“可能致病”（PVS1+PM3+PM2）。

致病性的基因解碼分析

MADaM 是由 MTX2 基因突變引起的，該基因編碼一種稱為 Metaxin-2 的線粒體外膜蛋白。 Metaxin-2 (MTX2) 直接與 Metaxin-1 (MTX1) 相互作用，后者是線粒體分選和組裝機(jī)器 (SAM) 的一部分，負(fù)責(zé)將 β-桶蛋白正確整合到線粒體外膜中。 由基因解碼進(jìn)行的結(jié)構(gòu)功能研究表明，MTX2 缺失會(huì)導(dǎo)致 MTX1 蛋白水平降低，并導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)斷裂、氧化磷酸化降低、抵抗 TNF-α 引發(fā)的細(xì)胞凋亡、衰老和自噬增加、增殖減少以及核形態(tài)異常 。 這些賊終導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的早衰癥狀。

突變位點(diǎn)的人類遺傳物質(zhì)高精度定位分析

MTX2位于染色體2q31.1上，由263個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)功能域：Sam37/metaxin_N域(41-162AA)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)域(187-249AA)。 佳學(xué)基因分析了MADaM 患者中的 6 種 MTX2 變異，所有變異均為純合子且來(lái)自 6 個(gè)近親家庭。 存在 3 個(gè)剪接突變、2 個(gè)移碼突變和 1 個(gè)錯(cuò)義突變。 本病例的c.378+1G>A突變是剪接突變，預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致外顯子6跳躍。 MTX2 的外顯子 6 編碼 96 至 126 個(gè)氨基酸，并且外顯子 6 的跳躍預(yù)計(jì)會(huì)丟失 Sam37/metaxin_N 結(jié)構(gòu)域的一部分。