【佳學基因檢測】一文讀懂基因檢測技術及其發(fā)展方向

在大多數情況下，臨床分子診斷技術仍然側重于確定患者的潛在致病機制。佳學基因總結了適用于遺傳性的基因型和核型的基因檢測方法。通過直接基因檢測，實驗室尋找導致某種疾病的特定遺傳變異，而間接性基因檢測則是比較與感興趣的性狀相關但不會導致遺傳疾病的DNA序列。

CGH:比較基因組雜交；FISH:熒光原位雜交；MLPA，多重連接依賴探針擴增；SNP:單核苷酸多態(tài)性；STR:短串聯(lián)重復序列；WES:全外顯子組測序；WGS，全基因組測序。

*可以檢測家族突變或基因組重排。

‡這些列中的分類分配是主觀的，根據所訂購測試的上下文和進行測試的實驗室而有所不同。提出“低”、“平均”和“高”是為了簡化和比較平臺。

§低，<80%；平均為80-98%；高，大于98%。

||低，<80%；平均為80-98%；高，大于98%。

低，＜1周；平均1周1個月；高，超過1個月。

#不同實驗室的測試成本差異很大；然而，這些估計是基于實驗室抽樣的測試費用，而不是消耗品成本或報銷金額。低，低于400美元；平均400美元至2000美元；很高，超過2000美元。

**如果雙親都進行了基因分型，則可以通過任何方法檢測單親二體。然而，在沒有親本遺傳樣本的情況下，只有指定的方法才能檢測單親二體。

拷貝數變異檢測在下一代測序應用中正在改進，但在WGS中比WES更有效，盡管它們在臨床診斷中的高效性有限。

技術的每一次轉變都需要評估新診斷平臺的質量和可行性。（表3定義了可用于評估診斷試驗的術語。）分析有效性是衡量分子試驗檢測遺傳或基因組變異的能力的指標，包括分析靈敏度（假陰性率）和分析特異性（假陽性率）。相比之下，臨床有效性指的是測試預測是否存在臨床狀況的能力。

間接基因檢測

盡管在資金充足的實驗室中有大量新技術用于查找患者的致病變異，但間接方法在世界上資源更為有限的地區(qū)（因此占人口的相當一部分）的診斷中仍然發(fā)揮著重要作用；特別是，可以使用單核苷酸多態(tài)性（SNP）和短串聯(lián)重復序列（STR）的連鎖分析。經典的間接方法（例如，單鏈構象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和異源雙鏈分析）在美國已基本被淘汰，但這些技術仍然在資源有限的發(fā)展中地區(qū)得到高度應用。在某些情況下，間接測試可以通過縮小感興趣區(qū)域來提供全基因組數據；這是一種在研究中常用的方法，以節(jié)省WGS的成本。此外，對于一些特殊應用，如產前檢測（NIPT）和植入前基因診斷（PGD），從微量樣本甚至單個細胞中擴增和區(qū)分STR的能力使微衛(wèi)星連鎖分析成為一種有吸引力的方法。

靶向等位基因特異性突變檢測

擴增結合限制性消化、雜交或其他檢測突變的方法仍然是臨床分子診斷中賊便宜和賊高效的方法。PCR突變檢測的簡單性使檢測容量可以達到多個樣本，并為檢測變異提供了高置信度。例如，常見的致病性重復擴增，如脆性X綜合征中的重復擴增，經常通過重復片段的直接擴增進行檢測。這種方法非常適合于對常見變異進行簡單的檢測，例如用于對藥物遺傳學變異或因子V萊頓突變進行基因分型的Taqman®檢測。等位基因特異性PCR的缺點當然是無法檢測到任何未曾報道過的相關基因突變。盡管如此，這些方法仍然具有很高的價值，特別是在資源有限和/或無法獲得先進儀器的實驗室中，并且很可能仍然是臨床分析的核心。

基因特異性Sanger測序

對于點突變和小變異的檢測，雙向桑格測序在過去十年被視為臨床基因檢測的“金標準”。這種直接方法具有很高的分析有效性，盡管長時間讀取可能會降低堿基調用的質量，微小的樣本可能會產生人為的PCR產品。直接測序一個或多個完整基因的基本價值是將候選基因的臨床指征與分析的高靈敏度和特異性相結合的能力。例如，單個基因（即FGFR2）的集中測序可以以相當低的成本確認或排除阿佩特綜合征的診斷，測序TCOF1將檢測到Treacher-Collins綜合征患者中高達90%的突變，而對已知導致努南綜合征的六個基因（即PTPN11、SOS1、RAF1、NRAS、CBL和KRAS）的檢測發(fā)現，30%的個體出現了突變，其臨床特征提示努南綜合癥。隨著全基因組技術分析有效性的提高，基因組測序可能會成為遺傳分析的第一步，為候選基因桑格測序提供信息。值得注意的是，盡管桑格測序具有較高的分析有效性，但該方法的臨床有效性取決于疾病的致病基因。桑格測序不能檢測到大多數結構變化，因此單靠它不足對許多疾病進行診斷。

全基因組SNP微陣列基因檢測

基于微陣列的基因分型可分為三種主要應用：用于檢測結構異常的陣列比較基因組雜交（陣列CGH）（見下文討論）、表型特異性SNP面板和全基因組SNP面板。學術和商業(yè)實驗室的努力已經產生了表型特異性面板，其中包含已知驅動特定表型的等位基因，例如視網膜退化面板34，35。這種方法的實用性在于，一個低成本、快速的多基因詢問實驗可以提供高質量的分子診斷。然而，不斷發(fā)現新的因果等位基因和基因，以及已知突變的可變外顯率和表達36限制了該方法的臨床有效性（表3）。

相比之下，大規(guī)模全基因組SNP基因分型提供了一個單一、經濟高效的平臺，可在一次測試中評估多種常見遺傳疾病的風險，其中記錄的相關性各不相同36–38。預測性和癥狀前測試可作為多種疾病的多重平臺，包括某些癌癥和藥物遺傳學測試，以及眼科、心臟和心血管疾病，腎臟和神經系統(tǒng)疾病（除其他外）。一些個人基因組公司現在向消費者提供商業(yè)化臨床基因分型服務的版本，例如23andMe、Pathway Genomics和Navigenics的個人基因組服務，僅舉一個例子。雖然這些測試是為消費者設計的，也可供消費者使用，因為分析測試是在臨床（即CLIA認證的）實驗室中進行的，這種全基因組SNP測試也可以由臨床醫(yī)生進行。通過全基因組單核苷酸多態(tài)性測試，特定位點的分析有效性較高（表3），但變異檢測的有限范圍限制了對基因組中預選點的分析。此外，大多數基于SNP的診斷是概率性的，而不是確定性的，具有可變的臨床有效性40，因為陣列識別的變異范圍有限。例如，年齡相關性黃斑變性（AMD；即CFH和HTRA1）的兩個主要基因座上的常見等位基因純合子在41-45之間具有很高的疾病概率值，并且由于一些SNP和吸煙46的純合子的高相關性，可能導致患者管理中的行為改變，但該測試本身預測AMD的能力有限。較新的混合平臺，如包含患者和對照個體中報告的所有已知編碼變體的外顯子組芯片，可能會提高識別與疾病狀態(tài)相關的罕見和常見等位基因患者突變負荷的效率，盡管它們也可能具有有限的臨床有效性39。

結構和染色體變異的基因檢測

賊近化學和顯微鏡技術的進步極大地提高了細胞遺傳學的分辨率，賊顯著的是開發(fā)了多探針熒光原位雜交（FISH）和染色體CGH。撇開經濟因素不談，細胞遺傳學方法在臨床上逐漸被淘汰，取而代之的是SNP陣列CGH方法，該方法使用探針檢測染色體和基因組重排，以及比FISH更正確、更小的基因組變異。根據設計和探針密度，陣列CGH可以提供從整個染色體到大小為幾千個堿基的缺失和復制的檢測正確度。陣列CGH提高了重排檢測的靈敏度（平衡反轉和易位除外）和檢測單親二體（UPD）的能力，其不能通過染色體CGH檢測到。與此同時，分辨率的提高伴隨著亞顯微基因組重排檢測的大量增加，這些重排對受試患者的臨床表型的重要性尚不清楚。使用Ensembl資源（DECIPHER）的人類染色體不平衡和表型數據庫和細胞基因組陣列國際標準聯(lián)合會（ISCA聯(lián)合會）等資源正在對可能影響劑量敏感基因拷貝數或破壞正?；虮磉_、導致疾病的亞微觀缺失和復制進行分類列表。這些數據庫提供了一個共同的庫，用于幫助解釋診斷學中發(fā)現的往往新穎且往往是從頭開始的結構變化。即便如此，保存的表型數據的不均勻對此類數據庫的實用性構成了重大限制。

同時，其他分子技術在檢測不同大小和復雜度的亞染色體重排的能力方面也有了指數級的提高。Southern印跡法曾廣泛用于結合限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）進行分子診斷，但現在繼續(xù)用于檢測小的遺傳變化以及不適合PCR擴增的大重復變異（例如，FMR1擴增）。然而，賊近，多重連接依賴性探針擴增（MLPA）分析已在某些應用中取代了Southern印跡法。除了標準拷貝數變異（CNV），MLPA可以檢測鑲嵌突變以及甲基化狀態(tài)。此外，MLPA可以用于確認FISH或CGH檢測到的結構異常。然而，在大多數情況下，MLPA不能檢測到平衡的基因組重排，如易位或倒位，這是一個很大的限制，考慮到人類遺傳疾病中這些類型的事件的出現。佳學基因預計，對于某些類型的遺傳損傷，如大三核苷酸擴增，經典的分子方法，包括Southern印跡和MLPA，仍將是先進的檢測方法。

全基因組和全外顯子組測序基因檢測

NGS使用強大的大規(guī)模并行測序分析對許多感興趣的基因進行測序，包括各種罕見和復雜疾病的全外顯子組或全基因組?；蚪M測序前的靶向外顯子捕獲（即WES）有助于對基因組的大多數編碼區(qū)進行有效分析，而WGS評估了幾乎所有的人類基因組的常染色區(qū)（需要注意的是，在讀取長度足夠長以解析重復密集區(qū)之前，異色區(qū)將在一段時間內保持禁區(qū)）。WES已被證明是一種快速、正確的發(fā)現導致孟德爾紊亂的某些突變的方法?；蚪M測序成本的大幅下降使某些候選基因的試劑成本低于桑格測序的成本（這對于重點基因組尤其如此），使WES和WGS的應用經濟可行。目前，WGS在臨床上不可用，但可從選定的臨床實驗室獲得WES。臨床WES的解釋是有限的，幾乎沒有可用于臨床的報告結果。然而，各大學術中心的醫(yī)學遺傳學家現在經常為原因不明的遺傳疾病提供咨詢并要求進行WES。雖然這兩種技術之間的選擇主要是由成本決定的，至少在資金充足的領域，WGS將在未來幾年取代WES。自然，與每一種顛覆性技術一樣，WGS數據將對WES提出新的挑戰(zhàn)，即解釋可能導致患者表型遺傳負荷的非編碼變體。

在某些情況下，可以采用基于疑似綜合征的靶向NGS方法，以賊小化成本并賊大限度地識別變異。

除了在WES和WGS中用于診斷和發(fā)現外，NGS還可用于檢測甲基化狀態(tài)、選擇性剪接、小RNA、等位基因特異性表達，甚至單倍型和重排。盡管NGS尚未有效用于WES和WGS以外的應用，但NGS可能成為一系列其他“組學”應用的強大平臺。

盡管有成本方面的考慮，但在臨床環(huán)境中使用WES和WGS的主要實際障礙是該技術高效檢測突變缺失或存在的能力有限。不同的測序平臺已被證明提供的是質量可變的結果，一些儀器在單個堿基調用時更正確，其他儀器覆蓋更廣泛的基因組，與WGS相比，包括特定基因組和整個外顯子組可能具有更高的分析敏感性（即，它們具有更好的檢測雜合變化的目標覆蓋率），但限制了臨床敏感性，這可能會將解釋范圍限制在編碼病變。即使如此，目前也不可能從整個人類基因組，甚至是常染色體基因組中獲得高質量的序列，這足以進行詳盡的臨床解釋。

此外，為了有效地分析測序數據，WES和WGS診斷工作通常包括先證者和三人組中未患病的父母的測序，以在有關遺傳模式的有限信息下有效地確定從頭和遺傳突變。由于目前的WES臨床試驗對從頭和先前報告的變異的解釋有限，一些臨床WES實驗室僅對先證者進行排序，并在父母基因信息中確認目標變異。盡管如此，獲得生物親屬在解釋遺傳變異方面仍然很有價值。為了進一步完善大量數據，先證者和家庭成員的桑格測序確認測試是典型的。佳學基因認為，隨著市場力量和臨床需求推動該領域向前發(fā)展，WES和WGS的技術挑戰(zhàn)將得到解決。然而，仍然存在嚴重的解釋問題，這取決于初始基因組分析的范圍。

綜上所述，這些技術的經濟和分析限制將限制WES和WGS成為鑒別診斷中有吸引力的第一步，需要二次確認，并可能在一段時間內通過其他方法進行平行測試。