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【佳學(xué)基因檢測】如何采用液體活檢檢進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測與NGS測序

近幾十年來,兒童癌癥的見效率已經(jīng)增加到約80%,但在發(fā)達(dá)國家,癌癥仍是一歲以上兒童疾病導(dǎo)致的主要死因。此外,許多幸存的癌癥兒童會因手術(shù)、細(xì)胞毒性化療和放射治療的長期后遺癥,包括精神殘疾、器官毒性和二次癌癥而受苦。開發(fā)更具特異性和損傷性更小的治療方法的關(guān)鍵步驟是解開兒科惡性腫瘤的完整基因譜系,這些腫瘤在組織病理學(xué)實(shí)體和分子亞型上不同于成人惡

佳學(xué)基因檢測】如何采用液體活檢檢進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測與NGS測序

 

采用液基細(xì)胞學(xué)處理后,使用Ion Torrent® Genexus®系統(tǒng)(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進(jìn)行了Oncomine®精密和全面腫瘤固體檢測面板(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)的下一代測序。腫瘤基因解碼基因檢測根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行處理:從液基細(xì)胞學(xué)樣本中獲取細(xì)胞,獲得細(xì)胞沉淀和刮取的細(xì)胞:刮取細(xì)胞時,移除蓋玻璃,將載玻片放入丙酮中直到脫落。接著,依次將載玻片放入丙酮/二甲苯混合液(1:1)中5分鐘,放入二甲苯中5分鐘,放入100%的乙醇中5分鐘,然后在室溫下晾干。腫瘤細(xì)胞被刮取并放入裝有消化緩沖液的1.5毫升管中。從液基細(xì)胞學(xué)樣本中獲取細(xì)胞沉淀,將其放入無菌的50毫升離心管中,然后離心5分鐘,速度為3000 rpm。棄去上清液,向沉淀物中添加1毫升的先進(jìn)酒精。然后,將混合物放入1.5毫升管中,進(jìn)行新的離心以去除上清液。賊后,將沉淀物在室溫下晾干,直到溶劑蒸發(fā)完畢,然后添加消化緩沖液。使用MagMax™ FFPE DNA/RNA Ultra檢測試劑盒(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進(jìn)行DNA和RNA的雙重提取。根據(jù)需要,使用Qubit Flex與Qubit 1x ds DNA HS測定套件和Qubit RNA HS測定試劑盒(賽默飛世爾科技,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆)進(jìn)行DNA和RNA濃度的熒光定量。根據(jù)Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板對細(xì)胞學(xué)樣本的建議,DNA的賊佳輸入量為0.67 ng/μL。準(zhǔn)備液基細(xì)胞學(xué)DNA樣本(1.1毫升)。剩余的液基細(xì)胞學(xué)樣本存儲在-80°C備用。DNA面板Oncomine®全面腫瘤固體檢測面板用于識別熱點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異(CNVs)(42)和融合變異,也可以識別全長基因。DNA面板Oncomine®精密腫瘤固體檢測面板用于識別熱點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異(CNVs)(14)和融合變異。使用Ion reporter 5.18軟件進(jìn)行NGS分析,以下是質(zhì)控(QC)閾值:對于單核苷酸分子變異(SNV/Indel),覆蓋率必須至少為2,賊低檢測截止頻率為0.035%和0.05%。進(jìn)行拷貝數(shù)變異(CNV)調(diào)用,必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn):平均先進(jìn)成對差(MAPD)< 0.5,p值< 10-5,拷貝數(shù)增加的CNV比例必須大于1.15,一次拷貝數(shù)減少的CNV比例應(yīng)小于0.85。

近幾十年來,兒童癌癥的見效率已經(jīng)增加到約80%,但在發(fā)達(dá)國家,癌癥仍是一歲以上兒童疾病導(dǎo)致的主要死因。此外,許多幸存的癌癥兒童會因手術(shù)、細(xì)胞毒性化療和放射治療的長期后遺癥,包括精神殘疾、器官毒性和二次癌癥而受苦。開發(fā)更具特異性和損傷性更小的治療方法的關(guān)鍵步驟是解開兒科惡性腫瘤的完整基因譜系,這些腫瘤在組織病理學(xué)實(shí)體和分子亞型上不同于成人惡性腫瘤。過去幾年,已經(jīng)啟動了許多針對特定疾病的測序工作,但迄今為止的幾項(xiàng)兒科泛癌癥研究只關(guān)注突變頻率、遺傳易感性和表觀遺傳調(diào)控因素的改變。

腫瘤基因解碼對兒童、青少年和年輕人的癌癥進(jìn)行了廣泛的探索,包括在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞水平上進(jìn)行的小突變以及拷貝數(shù)或結(jié)構(gòu)變異,并通過確定潛在的癌癥基因并將其與癌癥基因圖譜(TCGA)先前在成人癌癥中報(bào)道的基因進(jìn)行比較。腫瘤基因解碼還研究了突變信號和潛在的藥物靶點(diǎn)。

這項(xiàng)整合性分析包括24種類型的癌癥,涵蓋了所有主要的兒童癌癥種類,其中許多僅在兒童中出現(xiàn)。腫瘤基因解碼研究中的95%的病人在兒童或青少年時期(18歲或以下)被診斷,5%為年輕成人(賊多25歲)。腫瘤基因解碼研究偏向于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,另一項(xiàng)研究對主要有白血病和顱外實(shí)體腫瘤的非重疊兒科隊(duì)列進(jìn)行了補(bǔ)充。

腫瘤基因檢測整合了961個腫瘤(914個單獨(dú)的患者)的雙端Illumina基礎(chǔ)測序數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)來自之前的癌癥類型特定的研究,包括547個全基因組序列(WGS,中位覆蓋率37×)和414個全外顯子序列(WES,121×),部分由低覆蓋率全基因組補(bǔ)充。腫瘤和匹配的生殖細(xì)胞樣本通過標(biāo)準(zhǔn)化的管道處理,以檢測單核苷酸變異(SNVs)、短插入和缺失(indels)、拷貝數(shù)變異(CNVs)和其他結(jié)構(gòu)變異。二次(反復(fù))腫瘤(n = 82,包括47個與原發(fā)匹配)與主要的原發(fā)隊(duì)列(n = 879)分開進(jìn)行分析。

(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)
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