【佳學(xué)基因檢測】不同的肺癌患者采用血液循環(huán)游離DNA檢測EGFR基因突變的結(jié)果及預(yù)后

肺癌是全球致死率賊高的惡性腫瘤之一，也是中國賊常見的惡性腫瘤之一。每年，中國新增的肺癌病例約為60.95萬，位居惡性腫瘤之首。其中，約80%的病例為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），且75%的患者確診時已是晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療。目前，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）已成為攜帶EGFR基因敏感突變的NSCLC患者的一線治療藥物。通過基因檢測全面了解EGFR突變對NSCLC患者治療及預(yù)后的影響至關(guān)重要。

目前，通過活檢或術(shù)后腫瘤組織進(jìn)行EGFR基因檢測是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，臨床實踐中存在諸多局限，如腫瘤組織獲取困難、難以重復(fù)取材以及腫瘤異質(zhì)性等問題。液體活檢作為一種非侵入性或微侵入性的方法，通過檢測體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)游離DNA（cfDNA）和外泌體等來獲取腫瘤生物學(xué)信息。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、可重復(fù)、患者接受度高等優(yōu)點。cfDNA是指存在于患者血漿中的游離DNA片段，由正常及腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡或主動分泌進(jìn)入外周血循環(huán)，且其生物學(xué)信息與原發(fā)腫瘤高度一致。當(dāng)腫瘤組織難以獲取時，血漿cfDNA檢測是EGFR突變分析的合適替代選擇。

在對先進(jìn)代EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者中，約50%會出現(xiàn)T790M突變。該耐藥突變可能存在于原發(fā)腫瘤中，更常見于治療后的二次活檢樣本。因此，在隨訪和監(jiān)測方面，血檢具有更高的可操作性。

腫瘤正確用藥基因檢測旨在收集肺癌患者配對的血液及腫瘤組織樣本，進(jìn)行EGFR基因檢測分析，以探討NSCLC患者血液循環(huán)cfDNA檢測EGFR基因突變的敏感性和特異性。通過分析其臨床應(yīng)用及預(yù)后指導(dǎo)價值，為臨床常規(guī)應(yīng)用提供依據(jù)。

EGFR總體突變率與類型

在107例配對的血液和腫瘤組織樣本中，均成功進(jìn)行了EGFR基因突變分析（采用ARMS法）。統(tǒng)計分析顯示，EGFR突變在晚期肺癌患者中顯著增高，特別是在Ⅳ期患者中（血液樣本67.5%，組織樣本87.5%，P < 0.001，P = 0.002）。女性腺癌患者中突變率較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

血漿cfDNA檢測出EGFR突變60例，總體突變率為56.1%。突變類型主要包括19號外顯子缺失（19 deletion, 19Del）（27例，占45%）和21號外顯子突變（L858R）（22例，占36.7%）。另外11例為雙重EGFR突變（compound EGFR mutations），具體包括：19Del和T790M雙突變7例（11.7%），L858R和T790M雙突變2例，G719X和L861Q雙突變1例，以及19Del和L858R雙突變1例。

配對的腫瘤組織樣本中，EGFR突變檢出率略高于血液樣本，達(dá)到77.6%（83例）。突變類型包括19Del 44例（53.0%）、L858R 30例（36.1%），以及較少見的18號外顯子（G719X）突變和20號外顯子插入突變（20-INS）各1例。此外，檢測到7例雙重EGFR突變，包括：19Del和T790M雙突變4例（4.8%），19Del和L858R雙突變2例，以及G719X和S768I各1例。

血液與腫瘤組織EGFR突變結(jié)果比較

在107例配對的血液和腫瘤組織樣本中，EGFR突變分析結(jié)果顯示，兩者有效一致的樣本共73例（68.2%），其中包括49例EGFR突變型和24例野生型。檢測一致的突變類型包括19Del 27例（55.1%），L858R 21例（42.9%），以及G719X L861Q雙突變1例。

不一致的病例有34例（見表2），其中主要表現(xiàn)為假陰性，即血液樣本呈野生型而組織樣本為EGFR突變型（23例，占67.6%）。其余11例不一致者主要體現(xiàn)在EGFR突變類型差異上，尤其是血液樣本中T790M突變的檢出率更高（9例，占81.8%）。值得注意的是，沒有出現(xiàn)血液樣本假陽性的情況。

基于上述數(shù)據(jù)，血液cfDNA檢測EGFR基因突變的敏感性為72.3%，特異性為100%。血液檢測中EGFR突變型和野生型的一致率分別為81.7%和48.9%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001），這提示血液檢測EGFR突變陽性結(jié)果可能更高效。19Del和L858R突變的一致率分別為61.4%和70%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），表明血液檢測這兩種突變類型均較高效。

在107例血液樣本中，根據(jù)治療狀態(tài)將其分為三組。

治療前組：共有50例患者，在這組中，血液樣本中檢出EGFR突變31例（62%），而配對的腫瘤組織樣本中EGFR突變39例（78%）。兩者EGFR突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.081）。配對比較結(jié)果顯示，有效一致的樣本有37例（74%，為三組中賊高），其中包括19Del突變12例，L858R突變13例，G719X L861Q雙突變1例和野生型11例。檢測結(jié)果不一致的樣本有13例，主要為假陰性病例（9例，占69.2%）。有趣的是，有3例患者在治療前血檢中即發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變，而組織檢測結(jié)果為陰性。

靶向治療組：該組包含28例患者，血液樣本中檢出EGFR突變19例（67.9%），配對的腫瘤組織樣本中檢出25例（89.3%），兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.051）。與治療前的腫瘤組織樣本比較，檢測結(jié)果一致的樣本有16例（57.1%，為三組中賊低），其中包括19Del突變樣本10例，L858R突變樣本3例和野生型樣本3例。具體分析發(fā)現(xiàn)不一致的12例樣本中，假陰性和檢出含T790M雙突變的病例各占一半。

化療組：該組包括29例患者，血液樣本中檢出EGFR突變10例（34.5%，為三組中賊低），而配對的腫瘤組織樣本中檢出EGFR突變19例（65.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.018）。兩者檢測結(jié)果一致的樣本有20例（65.6%），包括19Del突變5例，L858R突變5例和野生型10例。重要的是，9例不一致的樣本全部屬于假陰性，提示傳統(tǒng)化療后血液中EGFR基因突變的檢出率顯著降低。

EGFR基因檢測與靶向治療預(yù)后分析

28例肺癌患者在接受靶向治療后，通過檢測血液cfDNA了解EGFR基因狀態(tài)，并對其進(jìn)行隨訪。根據(jù)血檢結(jié)果，將患者分為含T790M雙突變組（6例）和無T790M突變組（13例）。結(jié)果顯示，含T790M雙突變組患者的平均生存期為17.5個月，無T790M突變組的平均生存期為29.6個月，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。無T790M突變組的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）均顯著長于含T790M雙突變組。進(jìn)一步的分層分析發(fā)現(xiàn)，無論性別和年齡（< 60歲或≥60歲），含T790M雙突變組的預(yù)后均較差（P=0.005）。

進(jìn)一步將血檢結(jié)果細(xì)分為19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組進(jìn)行預(yù)后分析。結(jié)果顯示，19Del突變組患者的平均生存期為33.2個月，L858R突變組為19個月，含T790M雙突變組為17.5個月。三者在無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）方面的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。然而，通過兩兩對比分析發(fā)現(xiàn)，19Del突變患者在靶向治療后的PFS和OS顯著長于L858R突變患者和含T790M雙突變患者，而L858R突變與含T790M雙突變患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

分子靶向治療在肺癌患者中的應(yīng)用及其檢測方法

分子靶向治療已成為肺癌患者常規(guī)治療的重要部分。臨床病理通常采用侵入性方法，如通過活檢或手術(shù)獲取的組織進(jìn)行EGFR基因突變檢測。雖然這些方法具有明顯的優(yōu)點，但其缺點也不可忽視。一方面，這些侵入性方法難以重復(fù)取材并伴有一定風(fēng)險，并發(fā)癥發(fā)生率可達(dá)17%。另一方面，大部分非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者確診時已是晚期，約1/3的患者無法獲得適用于EGFR檢測的組織樣本。在這種情況下，血漿cfDNA成為肺癌患者EGFR突變檢測的一種有效替代選擇。近年來，這方面的研究快速發(fā)展。肺癌正確治療基因檢測通過對一組配對的血液和腫瘤組織樣本進(jìn)行EGFR基因檢測，比較其表達(dá)差異，分析血液cfDNA能否正確檢測EGFR基因突變及監(jiān)測耐藥基因T790M的變化，以指導(dǎo)患者的個體化正確治療。

研究發(fā)現(xiàn)與分析

肺癌正確治療基因檢測發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用ARMS-PCR法檢測血液cfDNA的EGFR突變總體一致率為68.2%，方法敏感性為72.3%，特異性為100%，比以往的研究[16]更佳。更有意義的是，在治療前組中獲得了血檢和組織檢測的賊高一致率（74%），而靶向組的賊低一致率為57.1%?；熃M中血液EGFR突變檢出率明顯低于組織（P=0.018），這與以往報道的化療后EGFR突變率降低[17]相符。這些數(shù)據(jù)提示術(shù)后輔助治療（包括傳統(tǒng)化療和靶向治療）可能影響血漿cfDNA的構(gòu)成，從而為了解殘余腫瘤狀態(tài)提供依據(jù)。

進(jìn)一步分析血檢和組織檢測不一致的病例發(fā)現(xiàn)：①在治療前組中，主要表現(xiàn)為假陰性（57.1%, 8/14），提示在無法獲得原發(fā)腫瘤組織時，血檢結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果。②在靶向治療組，不一致的病例中一半為假陰性，一半為含T790M雙突變。生存分析發(fā)現(xiàn)，含T790M雙突變組在無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）方面均顯著差于無突變組。因此，血液cfDNA檢測EGFR突變能更好地反映治療現(xiàn)狀并提示預(yù)后。Camidge等[18]研究發(fā)現(xiàn)，約一半的患者在接受連續(xù)的EGFR-TKI治療后出現(xiàn)繼發(fā)性T790M突變。第三代EGFR-TKI針對耐藥突變T790M已進(jìn)入視野，及時檢測及監(jiān)測用藥后T790M狀態(tài)成為臨床關(guān)注的新熱點[19, 20]。肺癌正確治療基因檢測同樣提示，血液cfDNA監(jiān)測T790M突變可以作為選擇靶向藥物的指針。③在化療組中，不一致的病例全部表現(xiàn)為血檢野生型而治療前原發(fā)腫瘤組織為EGFR突變型，這提示血檢在傳統(tǒng)化療后的隨訪監(jiān)測中可能存在局限性。

在治療前組中，有3例血液含T790M雙突變，而配對的腫瘤組織為陰性；另有1例血檢為雙突變（19Del、L858R），而組織為單突變（L858R）。我們分析這種情況可能的原因包括：在組織活檢取材過程中存在選擇性偏差，導(dǎo)致局部腫瘤組織與外周血所攜帶的生物學(xué)信息不一致[21]；腫瘤組織的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致與血漿游離DNA信息差異；T790M突變的腫瘤細(xì)胞亞群可能具有更高的增殖指數(shù)，易于侵襲性生長或壞死并釋放DNA入血。因此，肺癌正確治療基因檢測提示，血漿cfDNA比小體積的活檢組織更能全面反映腫瘤驅(qū)動基因狀態(tài)，均化組織異質(zhì)性造成的檢測偏差，為治療提供更加全面的信息。

不同突變類型的預(yù)后分析

對不同突變類型的患者進(jìn)行靶向治療后的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）分析，并對年齡、性別等因素進(jìn)行分層對比。結(jié)果顯示，無T790M突變患者的生存期均較含T790M突變患者長（PFS及OS），且不受性別和年齡的影響。靶向治療的不同EGFR突變類型患者中，19Del突變的預(yù)后賊佳，較L858R和含T790M雙突變患者的PFS和OS顯著延長；而L858R突變患者較含T790M雙突變患者的預(yù)后稍好，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與肺癌正確治療基因檢測一致，有文獻(xiàn)[22-25]報道19Del突變患者的靶向治療生存期較L858R突變患者更長。

結(jié)論

綜上所述，應(yīng)用ARMS法檢測血漿cfDNA的EGFR基因突變是一種特異性高、敏感性好的檢測方法，適用于晚期治療前肺癌患者的靶向檢測，是無法獲得組織樣本時的合適替代方法。其優(yōu)勢在于能夠全面反映腫瘤EGFR基因狀態(tài)，減少組織異質(zhì)性造成的檢測偏差。同時，該方法適用于應(yīng)用靶向治療后：①監(jiān)測T790M耐藥突變狀態(tài)，實時反映治療效果，指導(dǎo)用藥；②具有預(yù)后價值。然而，其局限性在于：①需謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果；②傳統(tǒng)化療后可能出現(xiàn)假陰性。全面了解這一檢測方法的優(yōu)缺點，有助于臨床選擇開展相應(yīng)工作及正確解讀結(jié)果。