【佳學(xué)基因檢測(cè)】狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹

狐臭、腋臭基因檢測(cè)導(dǎo)讀

個(gè)性化醫(yī)療和醫(yī)療保健的重要性日益受到重視。最近，人們已經(jīng)對(duì)與各種人類(lèi)遺傳疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及藥物引起的不良反應(yīng)相關(guān)的基因多態(tài)性進(jìn)行了深入研究，功能基因組學(xué)和全基因組關(guān)聯(lián)研究正在揭示其潛在的分子機(jī)制。了解某些基因多態(tài)性對(duì)于狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)了解個(gè)體間藥物反應(yīng)和/或疾病風(fēng)險(xiǎn)的差異具有臨床重要意義。隨著此類(lèi)證據(jù)的積累，需要新的臨床應(yīng)用和實(shí)踐。在這種情況下，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)高效的基因分型新技術(shù)勢(shì)在必行。在這里，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)描述了一種簡(jiǎn)單的等溫基因分型方法，該方法能夠檢測(cè)人類(lèi) ATP 結(jié)合盒 (ABC) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ABCC11 基因中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP) ，以及它在腋窩異味臨床診斷中的應(yīng)用。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道，腋窩異味與ABCC11基因中的一個(gè) SNP 538G>A 有關(guān)。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)的分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究表明，該 SNP 極大地影響了 ABCC11 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和功能。在《狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹》，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)強(qiáng)調(diào)了這種診斷策略在腋臭治療中的臨床相關(guān)性和重要性。

基于基因型診斷的新方法

ABCC11 538G>A 基因快速分型評(píng)估腋臭風(fēng)險(xiǎn)

ABCC11基因型 (538G>A) 與腋窩異味之間的關(guān)聯(lián)使狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)能夠?qū)σ父C異味進(jìn)行基于基因分型的診斷，這被認(rèn)為比基于表型的診斷更為客觀和準(zhǔn)確。因此，在臨床環(huán)境中，需要快速、簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)有效的按需基因分型方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)最近開(kāi)發(fā)了一種基于等溫 DNA擴(kuò)增技術(shù)的針對(duì)人類(lèi)ABCC11基因中的 S??NP 538G>A 的簡(jiǎn)單方法 （圖1(a)–1(c)）新方法可以在等溫反應(yīng)條件下 30 分鐘內(nèi)確定基因型，而無(wú)需分離基因組 DNA 和隨后的 PCR 步驟。

圖1：使用 SmartAmp 方法對(duì) ABCC11 538G>A 進(jìn)行基因分型。 (a) 基于 SmartAmp 的基因分型流程圖。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的熱處理以降解 RNA 和變性蛋白質(zhì)后，將血液樣本添加到反應(yīng)混合物中（總共 25 μ L），并在 60°C 下進(jìn)行恒溫孵育 30 分鐘，同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。(b)使用 SmartAmp 方法檢測(cè)ABCC11中的 SNP 538G>A。通過(guò)實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng) (Mx3000P; Stratagene) 監(jiān)測(cè)攜帶 538G (WT) 或 538A (SNP) 等位基因的ABCC11等位基因特異性引物與 SmartAmp 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加。(c) 基于 SmartAmp 的基因分型的人類(lèi)ABCC11基因示意圖和每個(gè)引物的相對(duì)位置。 （d）使用 CCD 攝像頭連接的數(shù)字處理器對(duì)基于 SmartAmp 的 SNP 分型進(jìn)行多端點(diǎn)檢測(cè)的示意圖。

2.2. 基因分型程序

在狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的方法中，整個(gè)DNA擴(kuò)增過(guò)程是通過(guò)設(shè)計(jì)總共5個(gè)引物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即回程引物（TP）、正向引物（FP）、增強(qiáng)引物（BP）以及外引物1和2（OP1和OP2）（表格1).另外，為了抑制錯(cuò)配序列對(duì)的背景擴(kuò)增，構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)性探針（CP），對(duì)ABCC11基因中的SNP 538G>A進(jìn)行有效的基因分型。

表1：用于檢測(cè)人類(lèi)ABCC11基因中的 WT 和 SNP 等位基因的引物組

TP：折返引物；FP：正向引物；BP：加強(qiáng)引物；OP：外引物；CP：競(jìng)爭(zhēng)探針。

由于該方法只需要少量（1-2  μ L）外周血，因此基因分型很容易。每個(gè) SNP 分型反應(yīng)在 60°C 等溫條件下在 25 μ L 反應(yīng)混合物中進(jìn)行 ?；旌衔锖?2.0  μ M FP、2.0  μ M TP、1.0  μ M BP、各 0.25  μ M OP、20  μ M CP、1.4 mM dNTP、5% DMSO、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM KCl、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4、8 mM MgSO 4、0.1% (v/v) Tween®20、1/100,000 稀釋 SYBR® Green I（Takara Bio Inc.，日本滋賀縣）和 0.24 U/ μ L Aac DNA 聚合酶（KK DNAFORM，日本橫濱市）。多態(tài)性 538G>A 以 TP 為特征。等位基因特異性 TP 和 FP 可誘導(dǎo) DNA 擴(kuò)增和隨后的自我引發(fā)延伸（產(chǎn)生更大的 DNA）。

通過(guò)引入 CCD 相機(jī)和計(jì)算數(shù)據(jù)采集，可以實(shí)現(xiàn)對(duì) SNP 依賴(lài)性 DNA 擴(kuò)增信號(hào)的多終點(diǎn)測(cè)定，即 SYBR Green I 的熒光增加，從而實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單、更具成本效益的檢測(cè)（圖 1（d））。

2.3. 基于 SmartAmp 方法的 DNA 擴(kuò)增過(guò)程

在基于恒溫 SmartAmp 的 DNA 擴(kuò)增的第一步中，F(xiàn)P 和 TP 與模板基因組 DNA 雜交。接下來(lái)，由各引物引發(fā)的擴(kuò)增產(chǎn)物從模板基因組 DNA 上分離。該過(guò)程由鏈置換 DNA 聚合酶誘導(dǎo)，其延伸分別由 OP1 和 OP2 引發(fā)。隨后，單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物成為第二步擴(kuò)增中相反的 FP 和 TP 的新模板。由于 FP 和 TP 的特殊性質(zhì)，這些擴(kuò)增子將在其 3′ 和 5′ 端重新折疊以形成新的引發(fā)位點(diǎn)，從而在進(jìn)一步的自我引發(fā)的 DNA 延伸中維持自我擴(kuò)增。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)在之前的報(bào)告中以示意圖形式說(shuō)明了 SmartAmp 反應(yīng)中串聯(lián) DNA 產(chǎn)物的形成。

CP 可抑制錯(cuò)配序列對(duì)的背景擴(kuò)增。例如，用于檢測(cè) WT (538G) 等位基因的 CP 被設(shè)計(jì)為替代 (538A) 等位基因周?chē)幕パa(bǔ)序列，并且其 3′ 端通過(guò)胺化進(jìn)行修飾（圖 1（a）)。因此，該 CP (538G) 抑制了 WT 等位基因的 FP 錯(cuò)退火以及隨后的基于 SmartAmp 的來(lái)自攜帶 SNP (538A) 等位基因的基因組 DNA 的擴(kuò)增。CP (538A) 以類(lèi)似的方式增強(qiáng)了等位基因特異性擴(kuò)增的檢測(cè)特異性。

2.4. 腋臭的臨床決策和治療

ABCC11基因的 SNP 基因檢測(cè)是醫(yī)生做出決定的臨床因素之一。攜帶 538G/G 或 538G/A 基因型的患者可以接受切除頂泌腺的手術(shù)，而攜帶 538A/A 基因型的患者則不適合進(jìn)行此類(lèi)手術(shù)（圖 2）。

圖 2：針對(duì)腋窩異味的診斷和治療的基因靶向策略。該策略將有助于腋窩異味的客觀診斷，尤其是對(duì)于有主觀嗅覺(jué)錯(cuò)覺(jué)的 ORS 患者。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，與 538GG/GA 基因型不同， ABCC11 538A/A 基因型的受試者患腋臭的風(fēng)險(xiǎn)很小。據(jù)《人體體味產(chǎn)生的多樣化原因及基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性》，該 SNP 與除臭劑的使用相關(guān)，而 538A/A 基因型的受試者不受腋臭的直接影響。特別是，對(duì)于患有嗅覺(jué)參考綜合征 (ORS) 的患者，他們往往僅僅因?yàn)閷?duì)體味的錯(cuò)覺(jué)而選擇積極的手術(shù)治療，遺傳證據(jù)將是診斷和非手術(shù)治療的有力工具。因此，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)提出了如圖所示的臨床決策樹(shù)圖 2。

2.5. 嗅覺(jué)參考綜合征與腋臭的鑒別

基于基因型的診斷對(duì)于嗅覺(jué)參照綜合征 (ORS) 患者尤其有用。許多 ORS 患者（在日本醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中也稱(chēng)為“jiko-syu-kyofu”）的特點(diǎn)是始終認(rèn)為自己的身體會(huì)散發(fā)出強(qiáng)烈和/或令他人反感的難聞體味。這些患者堅(jiān)信自己就是強(qiáng)烈氣味的來(lái)源，即使周?chē)娜朔裾J(rèn)。這種嗅覺(jué)錯(cuò)覺(jué)是 ORS 的主要特征，醫(yī)生有時(shí)會(huì)在診斷腋窩臭味時(shí)識(shí)別出這種癥狀。ORS 患者傾向于希望手術(shù)切除腋窩頂泌腺能從根本上解決他們的問(wèn)題，即使這與醫(yī)生的臨床判斷相反。由于醫(yī)生對(duì)這種產(chǎn)生氣味的疾病的主觀診斷對(duì)這些患者來(lái)說(shuō)在心理上難以接受，因此，表明他們沒(méi)有風(fēng)險(xiǎn)的客觀證據(jù)對(duì)于勸阻他們不進(jìn)行手術(shù)非常重要。此外，如果盡管進(jìn)行了手術(shù)，但體臭的困擾仍未得到緩解，導(dǎo)致這些患者對(duì)自己的體臭更加緊張，那就太不幸了。因此，即使患者或家屬對(duì)此感到焦慮，也應(yīng)避免僅根據(jù)他們的要求進(jìn)行不必要的手術(shù)。因此，對(duì)ABCC11 SNP 538G>A 進(jìn)行基因分型可以以客觀的方式提供科學(xué)證據(jù)，作為臨床醫(yī)生主觀/經(jīng)驗(yàn)評(píng)估的替代方法。

進(jìn)一步了解ABCC11 538G>A

《體味的發(fā)病原因基因解碼》在人類(lèi)ABCC11基因中發(fā)現(xiàn)了 10 多個(gè)非同義 SNP ，但只有 538G>A (Gly180Arg) 與上述表型直接相關(guān)。SNP 538G>A 位于外顯子 4 中，其中 Gly180 被 Arg180 取代，位于 ABCC11 蛋白的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中。這種氨基酸取代導(dǎo)致新生 ABCC11 蛋白的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。SNP 變體 ABCC11 Arg180 經(jīng)歷蛋白酶體降解并失去其細(xì)胞內(nèi)功能（圖 3）。這種分子機(jī)制與人類(lèi)耳垢和腋窩臭味等頂泌腺相關(guān)表型屬于孟德?tīng)栃誀畹氖聦?shí)相一致。事實(shí)上，人類(lèi)頂泌腺的熒光免疫組織化學(xué)分析表明，ABCC11 Gly180（野生型：WT）在腺體中表達(dá)，而非同義 SNP 538G>A 極大地影響了 ABCC11 蛋白在頂泌分泌細(xì)胞中的細(xì)胞定位。

圖 3：SNP 基因型 (Arg180) 對(duì) ABCC11 蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞內(nèi)降解的影響。 (a) 為了評(píng)估 Arg180 變體對(duì) ABCC11 蛋白質(zhì)水平的影響，在蛋白酶體抑制劑 MG132 存在下培養(yǎng)表達(dá) ABCC11 WT 或 Arg180 變體的 Flp-In-293 細(xì)胞 24 小時(shí)。用糖苷酶 PNGase F 處理后，通過(guò)用 ABCC11 特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析 ABCC11 WT 和 Arg180 變體蛋白。將信號(hào)強(qiáng)度比 (ABCC11/GAPDH，內(nèi)部控制) 標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照并表示為平均值±SD。 (b) ABCC11 WT 的翻譯后修飾和 Arg180 變體的蛋白酶體降解的示意圖。

盡管決定顯性表型的 ABCC11 內(nèi)源性底物尚未闡明，但最近的研究結(jié)果表明 ABCC11 WT 有助于人類(lèi)頂泌腺的發(fā)育和/或分泌活性的調(diào)節(jié)。例如，在手術(shù)切除過(guò)程中，通常在腋窩腋臭患者的腋窩中觀察到大而廣泛的頂泌腺。濕型耳垢來(lái)自外耳道頂泌腺的分泌產(chǎn)物，而干型表型中缺乏這種頂泌腺分泌物。此外，根據(jù)狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)耵聹頂泌腺組織切片的初步分析，538G/A 受試者的頂泌腺管腔面積大于 538A/A 受試者的頂泌腺管腔面積（圖 4）頂泌腺的總分泌活性取決于組織發(fā)育和調(diào)節(jié)頂泌腺分泌的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，因此，ABCC11 WT 應(yīng)參與人的頂泌腺的發(fā)育，導(dǎo)致頂泌汗液的過(guò)量產(chǎn)生，包括腋臭的前體化合物。新近，基因解碼證明，ABCC11 538A/A 基因型不會(huì)導(dǎo)致前體的完全缺失，并且與 538G/G 或 G/A 基因型相比，產(chǎn)生的前體化合物水平明顯較低。這些發(fā)現(xiàn)表明， ABCC11 538A/A 基因型的頂泌腺幾乎沒(méi)有分泌活性。他們推測(cè)，他們的結(jié)果是由于 Arg180 變體中 ABCC11 活性水平極低造成的。然而，對(duì)這種極小分泌的更合理解釋可能是，除了 ABCC11 之外，調(diào)節(jié)頂泌腺總分泌活性的其他因素也有助于促進(jìn)頂泌腺的分泌。要闡明這一點(diǎn)，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步解決 ABCC11 蛋白如何參與頂泌腺的調(diào)節(jié)的問(wèn)題。

圖 4：ABCC11 538GA 和 538AA 的人類(lèi)頂泌腺圖像分析。（a）外耳道中人類(lèi)頂泌腺的典型圖像（左）。圖像分析測(cè)量參數(shù)示意圖（右）。（b 和 c）ABCC11 538GA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（灰色），而 538AA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（白色）。使用 ImageJ 程序 (v1.46d) 分析了人類(lèi)頂泌腺 的組織學(xué)圖像。計(jì)算數(shù)據(jù)以箱線圖表示。當(dāng)p < 0.01 ( ∗ )時(shí)，差異被認(rèn)為是顯著的。

有趣的是，如圖圖 5所示例如，人類(lèi)ABCC11基因中 SNP 538G>A 的等位基因頻率在不同種族群體之間存在很大差異，反映了智人洲際遷徙歷史上人類(lèi)基因組的遺傳多樣性。根據(jù)流行的“走出非洲”理論，古人類(lèi)應(yīng)該攜帶ABCC11 538G 等位基因，對(duì)應(yīng)頂泌腺的高分泌表型。考慮到人類(lèi)腋窩中類(lèi)信息素化合物的產(chǎn)生可能源自腋窩頂泌腺，受 ABCC11 直接或間接調(diào)控的腋窩氣味可能對(duì)古人和狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)的祖先之間的非語(yǔ)言交流非常重要。

圖 5：不同種族人群中ABCC11 538G (WT; Gly180) 和 538A (Arg180)的等位基因頻率

體臭、狐臭和腋臭到底是什么？是否可以進(jìn)行基因檢測(cè)？

腋臭的特點(diǎn)

人類(lèi)往往會(huì)散發(fā)出奇特的體味，但每個(gè)人的體味可能都是長(zhǎng)期存在的，也可能是微不足道的。在大多數(shù)文化中，體味常常被他人視為令人不快的事情，同時(shí)也會(huì)影響散發(fā)體味者的自信和自尊。為了解決這個(gè)問(wèn)題，人類(lèi)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出各種方法來(lái)管理體味，例如使用除臭劑、清爽噴霧和香水。在現(xiàn)代社會(huì)中，消除體味是日常打扮的一部分，就像洗手、做頭發(fā)和其他類(lèi)似活動(dòng)一樣。然而，導(dǎo)致體味個(gè)體差異的遺傳和/或環(huán)境因素及其分子機(jī)制是在基因解碼技術(shù)出現(xiàn)后，才得以明確。

腋臭是一種以腋窩有強(qiáng)烈氣味和大量出汗為特征的疾病。腋臭的癥狀通常在青春期出現(xiàn)，此時(shí)從出生時(shí)就存在的頂泌腺首次活躍起來(lái) 。衣服腋窩處的黃色污漬也會(huì)影響患者的生活質(zhì)量。因此，腋臭通常被看作是一個(gè)不受歡迎的問(wèn)題，尤其是年輕女性。特別是在亞洲國(guó)家，強(qiáng)烈體臭人群占人口的少數(shù)，腋臭往往更令人討厭。特別是在日本，腋臭已被認(rèn)定為一種疾病，其臨床治療由國(guó)民健康保險(xiǎn)制度覆蓋。

腋臭的主要成分是不飽和脂肪酸、羥基化支鏈脂肪酸、硫烷基烷醇和一些類(lèi)固醇，代表分別為 (E)-3-甲基-2-己烯酸 (3M2H) 、3-羥基-3-甲基己酸 (3H3MH)、3-甲基-3-硫烷基己烷-1-醇 (3M3SH) 、5 α -雄烯酮和 5 α -雄甾-16-烯-3 α -醇（圖 6)。此外，體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明，3M3SH 的假定前體 3M3SH 的谷胱甘肽結(jié)合物可通過(guò) ABCC11 WT 轉(zhuǎn)運(yùn)，提示 ABCC11 參與了腋臭的形成。已發(fā)現(xiàn)這些氣味成分的一些前體是由腋窩頂泌腺分泌的，這表明抑制腋窩頂泌腺的分泌和/或發(fā)育有助于預(yù)防或治療腋臭。

圖 6：人類(lèi)腋窩氣味化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

腋臭基因檢測(cè)的意義和作用

除腋臭外，ABCC11基因型可能與乳腺癌或藥物引起的毒性風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。根據(jù)《個(gè)人的基因序列與疾病風(fēng)險(xiǎn)》的研究，在日本人群中，攜帶ABCC11 538G等位基因的女性比攜帶 538A 等位基因的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)更高，而在白種人群中并未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)。日本的一個(gè)研究小組還表明，乳腺癌女性體內(nèi)的 ABCC11 表達(dá)與侵襲性表型和較差的無(wú)病生存期有關(guān) 。由于一些抗癌藥物及其代謝物是 ABCC11 的底物，因此患者對(duì)核苷類(lèi)化療的反應(yīng)可能會(huì)受到ABCC11基因型的影響。最近的一項(xiàng)高加索人肝臟隊(duì)列研究表明，ABCC11 SNP 1637C>T（Trp546Met）與 5-氟尿嘧啶（一種廣泛使用的抗嘧啶類(lèi)抗癌藥物）的毒性風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)。然而，在該歐洲病例研究中，并未發(fā)現(xiàn)ABCC11 538A 等位基因與 5-氟尿嘧啶毒性風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，最好在 538A 等位基因占主導(dǎo)地位的亞洲進(jìn)行，以闡明這個(gè)問(wèn)題。此外，ABCC11 如何影響乳腺癌或其起源仍有待澄清。有趣的是，基于它們的生物學(xué)相似性，有人提出乳腺是從頂泌腺進(jìn)化而來(lái)的。由于ABCC11的功能形式可能有助于乳腺以及頂泌腺的發(fā)育和/或活動(dòng)控制，因此需要從各個(gè)方面進(jìn)一步驗(yàn)證，不僅包括化學(xué)抗性，還包括ABCC11的生理功能和調(diào)節(jié)。

腋臭基因檢測(cè)的共識(shí)

在《狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹》章中，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)一種有效的基因分型方法，探討了人類(lèi)ABCC11 538G>A 作為腋窩異味風(fēng)險(xiǎn)因素的臨床重要性。這種基于基因分型的策略將有助于腋窩異味的診斷，因?yàn)楂@得的客觀證據(jù)將使 ORS 患者擺脫氣味錯(cuò)覺(jué)。狐臭的基因解碼正進(jìn)一步揭示頂泌腺分泌過(guò)程的分子機(jī)制，越來(lái)越多的證據(jù)強(qiáng)烈表明 ABCC11 有助于頂泌腺的功能，而ABCC11 538G>A 反映了頂泌腺的活動(dòng)。需要進(jìn)一步研究以闡明 ABCC11 及其從頂泌腺分泌的內(nèi)源性底物的生理功能。因此，驗(yàn)證臨床相關(guān)遺傳因素和開(kāi)發(fā)用于個(gè)性化醫(yī)療的系統(tǒng)將是下一步的重要步驟。