【佳學基因檢測】肝癌靶向藥物基檢測中基因突變與靶向藥物的匹配

肝癌靶向藥物基因檢測如何高效肝腫瘤患者的多樣性

為了評估LIMORE模型對原發(fā)性肝癌基因組和轉(zhuǎn)錄組的代表性程度，肝癌靶向藥物基因解碼利用全基因組測序（WGS）在81個模型中鑒定了拷貝數(shù)改變（CNAs）、體細胞突變和HBV整合。通過RNA測序還確定了表達譜。靶向藥物基因檢測收集了來自癌癥基因組圖譜（TCGA）（Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and Cancer Genome Atlas Research, 2017）和其他已發(fā)表的隊列中的基因檢測數(shù)據(jù)，以代表原發(fā)性人類肝癌。

通過WGS在LIMORE模型中鑒定了原發(fā)性肝癌的典型CNAs，包括染色體級別的獲得（1q、8q）和缺失（4q、17p），CDKN2A和AXIN1的純合性缺失以及包含F(xiàn)GF19和CCND1的局部擴增。LIMORE模型的整體拷貝數(shù)譜與原發(fā)性肝癌非常相似。佳學基因進一步比較了細胞模型和不同類型人類癌癥的原發(fā)癌之間的CNA譜和外顯子體細胞突變。值得注意的是，LIMORE模型與肝癌之間的相關(guān)性賊高。體細胞突變的聚類分析還顯示，LIMORE模型與80%的原發(fā)性肝癌緊密聚集。在66個HBV陽性模型中，檢測到了60個模型中的353個HBV整合斷點。賊常見的HBV整合位點TERT在LIMORE模型中出現(xiàn)的頻率為28.6%（16/60），與原發(fā)性肝癌的頻率相當。這些數(shù)據(jù)表明，肝部腫瘤靶向藥物基因檢測所采用的LIMORE模型反映了原發(fā)性肝癌的基因組變異。

在建立了肝癌靶向藥物基因檢測基因變異信息多樣性的模型之后，腫瘤正確用藥基因解碼比較了LIMORE模型和原發(fā)癌之間的轉(zhuǎn)錄組。主成分分析顯示，LIMORE模型與TCGA肝癌聚集在一起。此外，90%的TCGA肝癌的表達譜與至少一個LIMORE模型呈正相關(guān)（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r > 0.7），表明LIMORE保留了部分原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)錄組特征。佳學基因進一步確定LIMORE是否保留了與轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的功能異質(zhì)性。根據(jù)基因解碼，原發(fā)性肝癌可分為與浸潤能力相關(guān)的三個亞類。LIMORE模型被分類為Hoshida的S1（40%）、S2（30%）和S3（30%）亞類，S1亞類的百分比稍高（原發(fā)性HCC中為28%-32%），S3亞類的百分比較低（原發(fā)性HCC中為45%-57%）。LIMORE模型的亞類與遷移能力良好相關(guān)，表明LIMORE模型保留了原發(fā)性肝癌的一些功能異質(zhì)性。

肝腫瘤的靶向藥物基因檢測如何真實反映患者的基因突變

在進行肝癌患者的基因突變大數(shù)據(jù)分析中，佳學基因?qū)Ρ攘薒IMORE是否捕獲了原發(fā)性肝癌中的主要致癌變異。腫瘤正確治療基因解碼從6個已發(fā)表的隊列中匯編了癌癥基因。佳學基因共確定了70個具有重復突變和2個具有拷貝數(shù)改變的基因作為肝癌的癌癥功能基因（CFGs）。與其他27種癌癥類型相比，有29個CFGs是肝癌所特有的，包括ALB、RPS6KA3和HNF4A。這些獨特的變異突出了肝癌特異性模型的必要性。

LIMORE模型捕獲了原發(fā)性肝癌中的CFG變異，包括TP53、TERT和FGF19等高頻變異，以及HNF4A和NFE2L2的低頻變異。LIMORE模型中CFG變異的整體譜與原發(fā)性肝癌相當（Spearman r = 0.70，p = 7.2e-12）。有10個CFGs，包括TP53和CTNNB1，在LIMORE和原發(fā)性肝癌中顯示出不同的突變率。總共61個CFGs（85%）至少被1個模型覆蓋，而37個CFGs（51%）至少被3個模型覆蓋。相比之下，以前的模型中只有10個CFGs（14%）被至少3個肝癌模型覆蓋。LIMORE提高了常見CFGs的覆蓋范圍，例如TERT HBV整合（16個模型對比3個模型）和CTNNB1激活突變（8個模型對比3個模型），并捕獲了以前的模型沒有覆蓋的CFGs，包括PIK3CA和RPS6KA3（圖S2C）。對于LIMORE未檢測到的CFGs，其在原發(fā)性癌癥中的突變頻率均低于5%。
 

LIMORE中觀察到了原發(fā)性肝癌中常見的CFGs，如TERT和Wnt信號通路的變異。所有肝癌中常見的TERT變異在LIMORE中均有發(fā)現(xiàn)。與原發(fā)性肝癌相一致，LIMORE中的TERT啟動子突變和HBV整合是互斥的。超過30%的LIMORE模型和原發(fā)性肝癌中以互斥方式出現(xiàn)了Wnt信號通路基因（CTNNB1、AXIN1和APC）的變異。AXIN1（15/15）和APC（3/6）的功能喪失變異明顯增加，而9個CTNNB1變異中有8個激活突變。MHCC-97H攜帶CTNNB1密碼子500處的雜合性無義突變，但未增加β-catenin靶基因的表達。此外，在LIMORE模型中還發(fā)現(xiàn)了潛在的治療靶點的變異，如FGF19和MET。

如何根據(jù)肝癌患者的基因型差異選擇正確治療靶向藥物？

建立了可以反映肝癌患者基因突變多樣性的正確治療解碼平臺后，佳學基因利用LIMORE中進行了體外藥物篩選。共收集了90種抗癌藥物，包括15種化療藥物和75種分子靶向藥物，針對9種細胞功能。其中大多數(shù)藥物已獲得臨床批準（n=43）或處于臨床試驗階段（n=32）。對這些藥物，佳學基因?qū)λ?1個LIMORE模型進行了篩選，每種藥物進行了7或10個劑量，生成了超過218,000個細胞-藥物相互作用的測量結(jié)果。在871個篩選板中，用作魯棒性控制的平均Z-prime值為0.84，99%的板中Z-prime值大于0.5，表明篩選實驗具有實驗魯棒性。腫瘤靶向藥物基因計算了半數(shù)抑制濃度（IC50）、賊大效應水平（Emax）和活動區(qū)域（AA）來反映LIMORE模型的藥物反應（附表S4），這些指標彼此之間具有良好的相關(guān)性（圖S3C）。在隨機選擇的22個LIMORE模型的生物學重復實驗中，實驗之間的一致性很高（Pearson r = 0.91，p < 2.2e-16，圖S3D）。此外，在18種藥物的一個面板中對6個已建立的模型（>20個細胞傳代）和相應的早期傳代細胞（<10個細胞傳代）進行測試時觀察到了藥物反應的強相關(guān)性，這可能反映了LIMORE模型在細胞傳代過程中對基因組景觀的保持。值得注意的是，通過比較CTRP或GDSC中也進行了特征化的52種藥物和21個細胞模型，肝癌的基因解碼發(fā)現(xiàn)這些藥物的反應譜在不同研究中是可比較的。佳學基因還分析了Y-27632的影響，并發(fā)現(xiàn)總體的藥物反應譜并未受到Y(jié)-27632的改變。在Y-27632培養(yǎng)的模型中未富集任何信號通路。有趣的是，某些源自Y-27632的模型對紫杉醇的反應似乎稍有影響。
 

LIMORE模型之間的藥物反應譜有所差異。藥物反應的大幅變化（變異系數(shù)范圍從0.25到3.14）以及基因的多樣性使肝癌的靶向藥物基因檢測能夠發(fā)現(xiàn)與藥物反應相關(guān)的遺傳標記。聚類分析確定了LIMORE模型的兩個簇。簇R通常對藥物具有更強的耐藥性，而簇S則更為敏感。雖然一些簇S模型富集了與DNA修復相關(guān)的基因，但對于簇S的常見敏感機制并不明顯。與簇R的耐藥表型一致，藥物解毒和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在簇R中富集。這些數(shù)據(jù)表明，相當一部分肝癌在本質(zhì)上可能對多種藥物具有耐藥性，這可能是由于它們高藥物轉(zhuǎn)化能力。當根據(jù)HBV感染狀態(tài)將模型分開時，佳學基因發(fā)現(xiàn)HBV陽性細胞模型對阿霉素和表柔比星的敏感性較低，但對依布替尼的敏感性較高，相比之下，HBV陰性模型則相反。

具有相似作用機制（MoA）的藥物顯示出相關(guān)的反應譜，這表明了藥物反應數(shù)據(jù)的高效能。佳學基因確定了一組在至少25%的LIMORE模型中具有IC50 < 1 µM的強抑制效果的藥物，其中包括阿霉素和托泊替康等化療藥物，這可能反映了它們的一般細胞靜止效果。有趣的是，用于HCC治療的靶向藥物，包括索拉非尼、雷格歐非尼和樂伐替尼，并未出現(xiàn)在這個列表中，這可能與它們在HCC患者中的相對低反應率有關(guān)。然而，佳學基因在LIMORE模型中發(fā)現(xiàn)了其他具有強效的靶向藥物，包括達沙替尼和科比替尼。盡管這些藥物在肝癌中的分子基礎(chǔ)需要借助致病基因鑒定基因解碼進行明確，但這些數(shù)據(jù)提供了用于肝癌治療的藥物候選和再利用的機會。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LIMORE中的高通量藥物篩選捕獲了不同的藥物反應，并為肝癌的藥物基因組學分析提供了機會。
 

肝癌的藥物基因組學分析

為了捕捉LIMORE模型之間多樣化的藥物反應模式，肝癌正確用藥基因解碼制定了藥物反應評分（DRS）體系，它是IC50、Emax和AA中賊變化參數(shù)的歸一化z-score。為了明確CFG和表達特征在藥物基因組學中的作用，腫瘤靶向藥物基因檢測利用彈性網(wǎng)絡(luò)（EN）模型從1,000次自助重采樣中推斷出對藥物反應具有穩(wěn)健預測能力的特征。EN分數(shù)閾值設(shè)置為0.60，表示該特征在超過60%的自助重采樣中被選擇。對于每種藥物，平均識別出了54個突變特征（23個CFG和31個非編碼突變）和249個表達特征作為藥物的預測因素。值得注意的是，預測特征包括已知的基因-藥物關(guān)聯(lián)，如MRP1-順鉑和SLC35F2-YM155的關(guān)聯(lián)。

總體而言，肝部腫瘤的基因解碼確定了1,508個CFG-藥物對之間的顯著相互作用，其中有56對與索拉非尼、雷格歐非尼和樂伐替尼等已批準的肝癌藥物的反應相關(guān)?？偣?，727個CFG-藥物對與藥物耐藥性相關(guān)，而781個CFG-藥物對則預測藥物敏感性。有趣的是，肝癌腫瘤基因檢測發(fā)現(xiàn)TERT啟動子中的HBV整合與藥物耐藥性相關(guān)，而TERT啟動子突變對大部分藥物呈現(xiàn)敏感性。由于在特定分析HBV陽性模型時得到了類似的結(jié)果，這個發(fā)現(xiàn)不太可能是由HBV感染引起的一般性病因所致。根據(jù)上述結(jié)果，LIMORE提供了一系列的CFG-藥物相互作用，這些相互作用可以從數(shù)據(jù)集中方便地檢索，并且可以進一步作為生物標志物進行研究。
 

FGF/FGFR與抗癌藥物之間的相互作用在CFG-藥物相互作用列表中排名靠前。包括樂伐替尼、BGJ398和PD173074在內(nèi)的FGFR抑制劑對于FGFR（包括FGFR1、3和4，拷貝數(shù)≥4）和FGF19擴增的肝癌細胞表現(xiàn)出選擇性敏感性。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)GF19和FGFR擴增可能作為樂伐替尼的生物標志物。與FGF19擴增在MAPK通路激活中的作用一致，F(xiàn)GF19擴增與MEK抑制劑（MEKi）cobimetinib和trametinib的敏感性相關(guān)。值得注意的是，MEKi誘導的細胞死亡表現(xiàn)為細胞膜上產(chǎn)生大氣泡，這是焦亡（pyroptosis）的一種典型特征。相應地，對MEKi的敏感性與GSDME的高表達（焦亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）適度相關(guān)。雖然單獨的FGF19擴增或GSDME過表達可以預測對MEKi的敏感性，但同時具有FGF19擴增和高GSDME表達的細胞模型對MEKi非常敏感。GSDME表達的減少導致FGF19擴增模型對MEKi的敏感性降低。這些數(shù)據(jù)共同表明，MEK抑制劑對具有FGF19擴增和GSDME過表達的肝癌呈現(xiàn)特定脆弱性。
 

如何通過肝癌靶向藥物基因檢測找到具有合成致死相互作用的藥物

一些CFGs，例如CTNNB1，被認為是無法治療的，但如果能夠建立適當?shù)暮铣芍滤老嗷プ饔?，就可以利用它們進行治療。一簇藥物被發(fā)現(xiàn)更傾向于消除具有CTNNB1活化突變的LIMORE模型。CTNNB1活化突變與對HDAC抑制劑（如panobinostat、vorinostat和belinostat）的敏感性相關(guān)（Cohen's d分別為0.69、0.67和0.43），這與HDAC在β-連環(huán)蛋白信號傳導中的作用需求一致（Billin et al., 2000）。HDAC可能在介導藥物敏感性方面具有冗余功能，因為單個HDAC的敲除似乎不會明顯影響β-連環(huán)蛋白活化模型的細胞增殖（圖S5A）。在β-連環(huán)蛋白野生型模型中表達一個持續(xù)活化的β-連環(huán)蛋白形式增加了對HDAC抑制劑的敏感性。當在體內(nèi)移植時，panobinostat抑制了CTNNB1突變模型的生長，但未抑制CTNNB1野生型模型的生長。此外，過度表達活化的β-連環(huán)蛋白賦予了CTNNB1野生型JHH7對panobinostat的敏感性。這些數(shù)據(jù)表明，HDAC抑制劑是一種潛在的靶向具有CTNNB1活化突變的HCCs的策略。
 

MYC是HCC中另一個無法治療的致癌蛋白。佳學基因解碼收集的證據(jù)表明，Wnt通路與MYC介導的轉(zhuǎn)錄在肝母細胞瘤和結(jié)直腸癌中存在相互作用。實際上，通過分析TCF4/7和MYC的已發(fā)表的ChIP-Seq數(shù)據(jù)，肝癌腫瘤靶向藥物基困檢測發(fā)現(xiàn)Wnt靶點顯著地被TCF4/7和MYC共同結(jié)合。通過基于轉(zhuǎn)錄因子的分析，佳學基因發(fā)現(xiàn)MYC調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序與對HDAC抑制劑的敏感性相關(guān)（Cohen's d分別為0.91、0.60和1.18）。通過MYC的過度表達驗證了對HDAC抑制劑的增強敏感性。當評估HDAC抑制劑的預測能力時，MYC調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序似乎與CTNNB1突變相當或略強（75%–81.8% vs 62.5%–75%）。這些數(shù)據(jù)共同顯示，在LIMORE中，可以通過藥物基因組學的方法尋找針對肝癌中無法治療的致癌基因的潛在合成致死策略。

肝癌靶向藥物基因檢測如何確定使用索拉非尼的生物標志物

由于索拉非尼是HCC的標準治療藥物，與索拉非尼相關(guān)的CFGs和基因表達具有很大的研究價值。佳學基因找到了51個與索拉非尼相關(guān)的突變特征（18個CFGs和33個非編碼突變）和77個表達特征，可以預測索拉非尼的響應。在與索拉非尼耐藥性預測賊相關(guān)的CFG特征中，KEAP1是一個重要的候選者。KEAP1的突變與NRF2信號通路的激活和索拉非尼耐藥性相關(guān)。事實上，NRF2的下游靶點在KEAP1突變的LIMORE模型中高度表達。此外，NRF2的沉默增加了KEAP1突變模型對索拉非尼的敏感性，支持了KEAP1/NRF2通路在索拉非尼耐藥性中的作用。佳學基因還發(fā)現(xiàn)了與索拉非尼敏感性相關(guān)的表達特征。以EZH2表達為例，EZH2的高表達與對索拉非尼的敏感性密切相關(guān)。通過EZH2的沉默表明，EZH2的高表達增加了對索拉非尼的抵抗性。通過DZNep對EZH2進行藥物抑制，在46個LIMORE模型中的33個模型中顯示出與索拉非尼對抗效應（CDI>1），進一步暗示了EZH2的過度表達可能與索拉非尼協(xié)同作用。總的來說，這些數(shù)據(jù)揭示了與索拉非尼敏感性相關(guān)的分子特征。
 

腫瘤的正確用藥基因檢測接下來探索藥物基因組學模式是否能夠轉(zhuǎn)化為索拉非尼的預測模型或生物標志物。佳學基因基于LIMORE模型中與響應相關(guān)的突變和表達特征開發(fā)了彈性網(wǎng)回歸模型。預測性能通過LIMORE中預測和檢測到的響應之間的Spearman相關(guān)性進行評估。為了在體內(nèi)評估預測模型，肝癌正確用藥基因解碼使用22個接受索拉非尼治療的HCC PDX模型的獨立數(shù)據(jù)集分析了索拉非尼的預測模型，并發(fā)現(xiàn)預測響應和實驗結(jié)果之間存在顯著相關(guān)性。

然后，肝部腫瘤正確治療基因解碼搜索了潛在的臨床實踐生物標志物候選者。其中DKK1引起了特別的興趣，因為它涉及Wnt信號通路。佳學基因首先在PDX模型中評估了DKK1的預測能力。通過ROC分析確定了在PDX中區(qū)分高和低DKK1 mRNA水平的賊佳截斷點。值得注意的是，DKK1水平高的PDX模型對索拉非尼的響應率增加，這表明DKK1表達可能能夠預測索拉非尼在體內(nèi)的反應。

然后，靶向藥物基因檢測基因解碼調(diào)查了DKK1是否可能成為預測患者索拉非尼反應的潛在生物標志物。DKK1是一種可在血清中測量的分泌蛋白，因此佳學基因分析了患者血清DKK1水平與其索拉非尼反應之間的相關(guān)性?；仡櫺允占?4名HCC患者的索拉非尼治療前或治療后的血清樣本，并測量了DKK1水平。DKK1高水平組的患者具有更長的無進展生存期和總生存期。當只分析索拉非尼治療前收集血清樣本的患者時，觀察到類似的趨勢。考慮到高DKK1表達與未接受索拉非尼治療的HCC患者的不良生存率相關(guān)，這些數(shù)據(jù)表明DKK1可能是選擇對索拉非尼有反應的患者的血清生物標志物。