【佳學基因檢測】精子運動能力基因解碼如何指導基因檢測？

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

基因解碼是一種新型基因信息分析方法，它是基因檢測位點選擇和基因解讀的最終理論和實踐依據(jù)。本文介紹了基因解碼是如何解析精子運動力產(chǎn)生的刺激信號，精子細胞的鈣內(nèi)流這一過程的。它從一個方面揭示了男子不育癥的基因解碼和基因檢測的關系。

Catsper調(diào)控與[Ca2+]信號轉(zhuǎn)導

基因解碼表明兩種鈣離子通道調(diào)節(jié)男性生育能力，這是男性不孕癥基因檢測中需要考慮到，才能檢測更全，不漏檢。（1）調(diào)節(jié)儲存控制的鈣離子的進入的Orail通道，和（2）基因解碼研究最廣泛的鈣離子通道Catsper通道。精子特異性Catsper通道控制細胞內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）。采用小鼠所做的實驗表明，Catsper1和Catsper2缺失小鼠的鞭毛彎曲幅度較正常小鼠的精子低。在Catsper1和Catsper2敲除小鼠中，增加精子內(nèi)[Ca2+]i鞭毛彎曲和振幅可以異常低水平增加到正常的預激活水平。在大多數(shù)哺乳動物中，精子的活化依賴于鈣從細胞外空間或細胞內(nèi)的細胞器進入精子細胞質(zhì)。因此，Catsper通道至少控制著精子的游動行為。
 

pH調(diào)節(jié)Catsper離子通道

Catsper通道是一個pH敏感的離子通道，高pH水平是精子過度激活的必要條件。因此，調(diào)節(jié)精子酸堿特性的因素也會影響精子Catsper通道開放的程度?；蚪獯a研究發(fā)現(xiàn)，小鼠精子在人工堿化的細胞內(nèi)環(huán)境中會導致鈣離子增加。另外，孕酮、前列腺素和ZP3可通過增加[Ca2+]i誘導精子獲能和頂體反應。然而，后來的基因解碼表明，這些生物活性分子在精子頂體反應和獲能過程中引發(fā)的精子內(nèi)Ca2+的增加受精子內(nèi)pH微環(huán)境的影響。然而，目前還不有效清楚堿化對精子Catsper通道的影響。H+是酸堿微環(huán)境的主要調(diào)節(jié)者，Na+/H+交換蛋白（NHEs）和電壓門控H+通道1（HV1）是H+相關通道。NHEs將Na+導入質(zhì)膜并將H+輸出精子，而HV1去除細胞內(nèi)H+以維持精子中pH值（pHi）的平衡。此外，Ca2+腺苷三磷酸酶（Ca2+ATPase）泵從精子中去除細胞內(nèi)的Ca2+，同時允許H+通過質(zhì)膜進入。相應地，Catsper通道將Ca2+導入精子以維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。除此之外，Na，K-ATPase（NKA）和Na+/Ca2+交換蛋白（NCX）也會影響人類精子中的離子環(huán)境。事實上，高水平的細胞內(nèi)Ca2+和低水平的細胞內(nèi)H+有助于精子的過度活躍。不同離子通道與Catsper通道的關系如圖所示。?

 

 

H+通道

（1） Na+/H+交換通道

Na+/H+交換蛋白（NHEs）負責Na+和H+的交換。它們也是廣泛分布于所有原核生物和真核生物中的整合膜蛋白。NHEs包括由SLC9基因家族編碼，有13種NHE亞型，但在精子細胞中僅存在NHE1、NHE5和sNHE三種亞型。其中，sNHE是決定生育能力的關鍵亞型。也就是說，敲除NHE1和NHE5基因不會導致小鼠不孕，但是sNHE缺失或sNHE功能損傷會導致小鼠精子的活動性和能動性喪失而變得不育。通過提供氯化銨來提高pH值水平可以恢復部分生育能力，但是cAMP類似物可以有效恢復生育能力。此外，sNHE蛋白質(zhì)C末端具有一個核苷酸結合域。因此，sNHE亞型是生育能力所必需的，環(huán)核苷酸可能通過激活sNHE來控制Catsper通道和增加pHi。此外，sNHE有助于維持堿性環(huán)境，使Catsper通道進一步調(diào)節(jié)超極化。除了維持精子的pH值動態(tài)平衡外，sNHE還調(diào)節(jié)精子成熟度，促進上皮細胞對鹽和水的吸收。干擾sNHE的功能的突變會導致不孕。因此，靶向sNHE可能是開發(fā)新的避孕方法的一個有希望的策略。與Catsper通道一樣，sNHE位于精子鞭毛的主要部分，這表明Catsper通道可以感知pHi變化帶來的sNHE的改變來調(diào)節(jié)Catsper功能。 

（2） Hv1通道

Hv1是另一個電壓門控H+通道。與sNHE和Catsper通道類似，Hv1也位于精子鞭毛的主要部分。就其功能而言，Hv1和sNHE的主要區(qū)別在于Hv1僅通過從精子中去除細胞內(nèi)H+來維持細胞內(nèi)堿化。膜片鉗技術在人類精子獲能的生理過程中檢測到Hv1通道的負電流，這表明Hv1與精子獲能有關。有趣的是，這種負電流沒有從老鼠的Hv1通道檢測到。也就是說，小鼠精子中沒有H+通過Hv1排出。我們懷疑sNHE獨立完成小鼠精子的酸堿調(diào)節(jié)。如果是這樣的話，敲除小鼠Hv1基因應該不會影響生育能力，但是沒有足夠的證據(jù)證明這一假設，Hv1在小鼠體內(nèi)的實際作用機制有待進一步研究。

K+通道

sNHE誘導Na+和H+交換導致pHi升高，sNHE和Catsper均為電壓依賴通道。此外，細胞膜的超極化與電容有關。K+有助于維持精子膜電位的平衡。實現(xiàn)這一平衡的K+通道是SLO3和Kir通道。其中SLO3通道是精子特異性和pH敏感的K+通道。與Catsper通道類似，SLO3還與精子的多動和運動密切相關。影響Catsper通道的SLO3通道的另一個關鍵功能是維持精囊內(nèi)鞭毛的電流平衡。精子靜止跨膜電位范圍是−35至-45mv，但當K+從細胞中移出并啟動超極化時，精子跨膜電位降低到-70mv。隨后觸發(fā)一系列生理過程，包括Na+/H+交換活化、精子獲能和精子結合ZP3。
 

鈣通道

精子中存在三種鈣離子相關通道（Catsper通道、Ca2+ATPase和Na+/Ca2+交換通道）。Catsper通道負責Ca2+進入精子孔，促進精子運動。Ca2+ATPase是一種Ca2+/H+交換蛋白，它去除細胞內(nèi)的Ca2+，并允許H+進入精子細胞，與Catsper通道不同。Ca2+ATPase對Catsper通道和精子受精有負性調(diào)節(jié)作用。此外，Na+/Ca2+交換蛋白從精子中輸出一個Ca2+離子，并允許三個Na+離子進入，這對于維持細胞內(nèi)環(huán)境的Ca2+平衡至關重要。

碳酸氫鹽（HCO3−) 轉(zhuǎn)運蛋白

HCO3− 是精子獲能必不可少的，這通常被認為是精子活力早期激活的開始。例如，經(jīng)人工堿化處理的小鼠精子產(chǎn)生細胞內(nèi)Ca2+增加。添加HCO3− 顯示出同樣的效果，同時也增加了精子的跳動頻率。這些數(shù)據(jù)表明HCO3的運輸− 通過增加精子pHi影響精子活力。此外，HCO3− 激活非典型可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC），增加cAMP水平，以及cAMP介導的途徑，增加鞭毛搏動頻率（cAMP介導的途徑可以激活Catsper通道）。因此，HCO3− 激活Catsper通道是促進Ca2+的增加，這可能是通過增強cAMP的生成來實現(xiàn)的。此外，CFTR是一個與人類精子獲能有關的Cl− 和HCO3−跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。CFTR通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路來控制許多轉(zhuǎn)運蛋白。值得注意的是，CFTR轉(zhuǎn)運體的抑制會影響HCO3−-誘導cAMP增加，導致PKA活性降低。此外，降低CFTR活性也會通過調(diào)節(jié)cAMP下游信號級聯(lián)導致酪氨酸磷酸化降低和運動過度減少。HCO3− 轉(zhuǎn)運蛋白由精子中的SLC4、SLC26和CFTR基因家族編碼，這些轉(zhuǎn)運蛋白構成了哺乳動物細胞中與pH調(diào)節(jié)相關的跨膜蛋白的主要家族。Western印跡、免疫細胞化學、qRT-PCR和免疫沉淀結果表明，SLC26A3、SLC26A6和SLC9A3R1在小鼠精子鞭毛的中段被檢測到。在獲能和超極化過程中，這些蛋白質(zhì)相互作用以增加pH值。另一方面，HCO3− CFTR轉(zhuǎn)運蛋白位于鞭毛中部，但不與Catsper通道共定位?；蚪獯a推測HCO3− 通道通過影響頂體反應間接影響Catsper通道的開放或關閉狀態(tài)。

HCO3− 精子活力的早期激活信號。HCO3的產(chǎn)生是由碳酸酐酶（CAs）催化完成的。因此，CAs在受精過程中對精子至關重要。佳學基因，一個致力于通過研究體體內(nèi)的生命過程從而解讀基因作用的專業(yè)機構研究表明，CAs有三種作用：（1）催化生成HCO3−, (2） 調(diào)節(jié)精子的pHi，以及（3）調(diào)節(jié)精子頂體反應。CAII和CAIV是具有催化活性的核心亞單位，敲除它們中的任何一個都會降低精子活力、精子運動速度和精子搏動頻率。CAII位于精子的主要部分，Catsper通道也位于這里。另一方面，CAIV位于整個精子尾部的質(zhì)膜內(nèi)。對人類獲能精子和小鼠獲能精子施用碳酸酐酶抑制劑，如乙氧唑胺，結果表明，人類獲能精子的頂體反應增加，但小鼠獲能精子的頂體反應沒有增加。這些結果表明CAs在人和小鼠精子中具有不同的功能。然而，關于CAs如何參與精子受精的研究卻很少。CAs在運動過程中直接參與維持離子的平衡。例如，當向精子注入二氧化碳時，鞭毛搏動頻率增加，并且這種效應被乙氧基唑胺抑制。與野生型和CAIV−/− 小鼠相比較，CAIV的生理作用是為精子提供HCO3−，以刺激產(chǎn)生可溶性腺苷酸環(huán)化酶?？傊妓狒缚梢杂绊憠A性環(huán)境和HCO3− 精子中的濃度。CAs可能通過調(diào)節(jié)Catsper通道影響精子頂體反應。

調(diào)節(jié)Catsper通道的體內(nèi)生理信號

細胞外Ca2+如何進入精子尚不清楚，但與受精相關的一些生理刺激通過Catsper通道誘導Ca2+進入增加[Ca2+]i。這些刺激包括孕酮、環(huán)核苷酸（如cAMP、cGMP）、ZP糖蛋白、BSA和堿性去極化。這些元素共同誘導一系列的生理事件，包括獲能、頂體反應和受精。

環(huán)核苷酸誘導鈣離子進入

cAMP/PKA信號通路在哺乳動物中被用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。事實上，精子獲能是一個cAMP依賴的過程，它上調(diào)Ca2+濃度和酪氨酸磷酸化水平。環(huán)腺苷酸由多種腺苷酸環(huán)化酶（ACs）合成，通常分為兩類：跨膜腺苷酸環(huán)化酶（tmACs）和sAC。重要的是，sAC介導的cAMP/PKA信號級聯(lián)對精子獲能至關重要，因為sAC突變或sAC缺失的小鼠可以產(chǎn)生精子，但精子沒有向前運動，導致男性不育。給予sAC突變或sAC缺失小鼠cAMP類似物可以有效恢復先前喪失的運動能力，但精子在體外受精時仍然沒有表現(xiàn)出過度活躍。此外，sAC不僅參與cAMP的產(chǎn)生，還參與受精過程中的其他機制。具體來說，sAC在受精過程中有三種作用。首先，sAC是一種HCO3− 傳感器。HCO3-刺激后sAC結構域發(fā)生重排−, sAC通過提高精子中cAMP水平而被激活。sAC的第二個功能是充當pH傳感器。先前的研究表明，sAC調(diào)控著狗魚精子的酸堿平衡，其基因起到了監(jiān)測CO2和HCO3-濃度的作用，保持適宜的pH值微環(huán)境。sAC的最后一個功能是作為鈣離子傳感器或鈣調(diào)素。作為HCO3-的替代品−, Ca2+能刺激sAC與ATP結合產(chǎn)生cAMP。環(huán)腺苷酸是一種第二信使分子，參與許多生理過程，包括精子向卵子的趨化和獲能。一項研究表明，細胞外cAMP/cGMP增加了Ca2+濃度。當向精母細胞提供8-Br-cAMP/cGMP或提供堿性去極化以激活精母細胞時，細胞內(nèi)Ca2+濃度的Catsper依賴性增加從主節(jié)開始，并通過中段到達頭部。這個過程發(fā)生在幾秒鐘之內(nèi)。此外，與野生型精子相比，Catsper1突變精子的細胞內(nèi)ATP水平較低。此外，海洋無脊椎動物中的cGMP信號功能是將趨化劑轉(zhuǎn)化為鞭毛中[Ca2+]i的增加，從而增加趨化過程中的游泳行為。所有這些發(fā)現(xiàn)都表明，環(huán)核苷酸誘導精子主體部分的鈣離子內(nèi)流，但沒有明確的證據(jù)表明，這一環(huán)核苷酸介導的過程直接參與誘導[Ca2+]i增加。然而，通過使用8-Br-cNMP處理的細胞，一項研究已經(jīng)證明，環(huán)核苷酸調(diào)節(jié)孕酮最終增加[Ca2+]i。

基因解碼還發(fā)現(xiàn)，Catsper通道在ZP誘導的Ca2+進入小鼠精子過程中起著關鍵作用。使用膜片鉗技術，在Catsper1空白小鼠精子中檢測不到ZP刺激2分鐘后的Ca2+電流，表明Catsper通道是ZP誘導[Ca2+]i增加所必需的，并表明ZP誘導的[Ca2+]i增加從精子尾部開始并向精子頭部傳播。
 

ZP誘導Ca2+進入

女性生殖道中的卵母細胞外面有一層叫做ZP的保護性外膜。卵母細胞周圍的ZP蛋白在受精過程中非常重要，因為精子只有通過ZP蛋白完成頂體反應才能參與受精。事實上，ZP糖蛋白在小鼠體內(nèi)由三個亞單位組成：ZP1、ZP2和ZP3。而人精子中存在4個亞基ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。精子頂體與卵子ZP的接觸是如何導致[Ca2+]i增加的？事實上，精子接觸卵子時，精子需要通過ZP的能力（這是通過[Ca2+]i增加實現(xiàn)的）。頂體通過胞吐過程分泌囊泡，最終完成頂體反應。早期的研究報道，在體內(nèi)實驗中向獲能精子中添加ZP可增加[Ca2+]i，而添加ZP抑制劑（即tyrphostin A48、百日咳毒素和3-quinuclidinyl benzilate）可抑制ZP誘導的頂體反應并降低小鼠精子中Ca2+的細胞內(nèi)濃度。這些效應可能與G蛋白的信號轉(zhuǎn)導有關。β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-I（GalT-I）是ZP3的一種受體，它形成了一種異三聚體G蛋白復合物。GalT-I缺失小鼠精子仍能與ZP3結合，但精子失去了完成頂體反應和跨越ZP的能力。與能完成頂體反應的小鼠精子相比，人類精子不僅需要ZP3結合，而且需要ZP4結合。此外，哺乳動物瞬時受體電位（Trp）蛋白是Ca2+通道受體，對調(diào)節(jié)Ca2+進入小鼠精子至關重要。Trp被ZP3激活的G蛋白和磷脂酶C激活。ZP誘導的Ca2+進入精子有助于產(chǎn)生頂體反應和改變精子活力，這兩種功能都是通過附睪表達的β-防御素蛋白來實現(xiàn)的。
 

孕酮誘導鈣離子升高

黃體酮圍繞在雌性生殖道的卵子周圍，由卵丘細胞釋放。孕酮通過Catsper通道誘導Ca2+進入精子，從而促進頂體反應。已經(jīng)深入研究過孕酮是如何調(diào)節(jié)鈣離子濃度的。當人類精子暴露于孕酮濃度梯度以模擬精子接近卵子時，發(fā)現(xiàn)[Ca2+]i增加。直接向培養(yǎng)基中添加鈣離子未能誘導這一過程，但添加肌漿/內(nèi)質(zhì)抑制劑可阻斷[Ca2+]i的增加。這些數(shù)據(jù)表明，孕酮誘導的Ca2+內(nèi)流是通過釋放精子中儲存的Ca2+介導的，因此可能會影響精子的行為。Catsper通道增加[Ca2+]i的機制之一是通過釋放儲存的Ca2+，我們推測孕酮誘導的Ca2+內(nèi)流可能由Catsper通道介導。一項研究記錄了人類附睪和睪丸精子的Catsper電流，結果表明，Catsper通道在精子發(fā)育早期對孕酮敏感，這種敏感性在精子最終射精時逐漸增加到峰值。蛋白激酶和磷酸酶參與孕酮誘導的Ca2+增加：添加PKA抑制劑或蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑可減少孕酮誘導的Ca2+內(nèi)流和孕酮誘導的頂體收縮。2010年，兩個研究小組提出，作為魚精子中的孕酮受體，Catsper通道起著增加細胞內(nèi)鈣離子濃度的作用。此外，2011年的一項研究表明，孕酮是一種類固醇激素，通過一個明確的孕酮核受體調(diào)節(jié)Catsper基因的表達，從而激活人類精子中的Catsper通道。此外，Catsper蛋白是一種非基因組孕酮受體，堿性pH和孕酮刺激Ca2+內(nèi)流，但被Catsper抑制劑NNC55–0396和mibefradil阻斷。
 

其他通過Catsper通道誘導Ca2+進入的刺激物質(zhì)

另外一個促進鈣離子通過Catsper通道進入精子的刺激物是BSA。BSA在幾種哺乳動物精子獲能中起作用。BSA也能誘導細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，但在Catsper1基因敲除的精子中沒有這種作用。加入EGFP-Catsper1融合蛋白，恢復BSA誘導的細胞內(nèi)Ca2+濃度增加。用牛血清白蛋白觀察到的鈣濃度變化在幾秒鐘內(nèi)從精子主體傳播到中間部，最終傳播到頭部。

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