【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)米勒管異常和高雄激素血癥的發(fā)病原因以阻斷遺傳
在一項(xiàng)旨在發(fā)找發(fā)病原因、阻斷遺傳的基因檢測(cè)研究中，生殖科基因檢測(cè)項(xiàng)目分析了4名患有Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser綜合征和高雄激素血癥的染色體型為46，XX的青春期女孩?；驒z測(cè)揭示患者體內(nèi)的WNT4基因的分子分析揭示其具有一種新的基因突變（p.A233T）。功能研究顯示，類(lèi)固醇生成酶的部分抑制（HSD3B2的正常抑制）與OVCAR3細(xì)胞系中CYP17A1酶的異常再表達(dá)形成對(duì)比。第四個(gè)新的WNT4突變證實(shí)了這種信號(hào)分子參與了卵巢中的米勒發(fā)育和雄激素生物合成抑制?；蚪獯a還發(fā)現(xiàn)，該突變體部分缺乏抑制卵巢類(lèi)固醇生成酶的能力，17α-羥化酶表達(dá)異常。
查詢《生殖器官發(fā)育異?；驒z測(cè)》數(shù)據(jù)庫(kù)，記錄中存在三名攜帶 WNT4 基因雜合突變的少女。所有這些都顯示人類(lèi)生殖科這一疾病與 Wnt4 敲除小鼠驚人相似的表型表現(xiàn)：苗勒管發(fā)育不全或與高雄激素血癥的臨床和/或生物學(xué)證據(jù)相關(guān)的發(fā)育不全。對(duì)基因檢測(cè)突變體的體外研究表明，這些蛋白質(zhì)無(wú)法抑制 3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶 2 (HSD3B2) 和 17α-羥化酶 (CYP17A1) 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)雄激素過(guò)量產(chǎn)生，或穩(wěn)定 β-連環(huán)蛋白，導(dǎo)致子宮發(fā)育不全。
生殖科致病基因鑒定基因解碼基因檢測(cè)賊近開(kāi)展了一項(xiàng)合作研究，該研究分析了 WNT4 基因是如何參與女性生殖道和性腺發(fā)育的。苗勒管發(fā)育不全基因檢測(cè)報(bào)告了四名青春期女孩的 WNT4 基因分析結(jié)果，這些女孩因存在原發(fā)性閉經(jīng)和與正常 XX 核型和苗勒管缺陷相關(guān)的雄激素過(guò)多癥而轉(zhuǎn)診至兒科內(nèi)分泌和婦科診所。在這四個(gè)女孩中，女性生殖障礙基因檢測(cè)項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)了一種新的 WNT4 突變，然后通過(guò)體外系統(tǒng)對(duì)類(lèi)固醇生成酶抑制和 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化進(jìn)行了表征。體外實(shí)驗(yàn)出人意料地揭示了這種新的 WNT4 突變體僅特異性地去抑制一些類(lèi)固醇生成酶，這與之前鑒定的基因突變所產(chǎn)生的有效去抑制形成對(duì)比。
該項(xiàng)研究邀請(qǐng)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的參與并批準(zhǔn)了這項(xiàng)研究，四名患者均提供了知情同意書(shū)。她們呈現(xiàn)與苗勒管異常和雄激素過(guò)多癥相關(guān)的正常 46,XX 核型?；颊?1 為 15 歲，患有子宮發(fā)育不全和嚴(yán)重的痤瘡。血漿睪酮 (pl-T) 和 DHEA 水平升高：分別為 2.4 nmol/L（正常 0.3-2 nmol/L）和 10.2 μmol/L（正常 1.3-6.8 μmol/L）?；A(chǔ) LH 水平高（12.2 UI/L；正常 1.5-6 UI/L），對(duì) LHRH 測(cè)試的反應(yīng)增加（LH 峰值 19 UI/L）。患者 2 為20 歲，超重（身高 165 厘米，體重 85 公斤）和多毛癥。 Pl-T (3.4 nmol/L) 和 DHEA (14.7 μmol/L) 升高。 LHRH 測(cè)試顯示高度升高，峰值為 75 UI/L。超聲檢查顯示子宮發(fā)育不全?；颊?3 為23 歲，患有與多毛癥和痤瘡相關(guān)的子宮發(fā)育不全，并且激素水平相同：高 pl-T（3.5 nmol/L）、雄烯二酮（14.1 nmol/L；正常 1.7-6.9）和 DHEA（9.15 μmol/ L)。患者 4年齡為17 歲，患有嚴(yán)重的痤瘡和面部和背部多毛癥?；A(chǔ) LH 水平增加（10.1 UI/L）。雄激素升高（pl-T：3.6 nmol/L；雄烯二酮：11.4 nmol/L；DHEA：7.0 μmol/L）。超聲檢查顯示子宮發(fā)育不全、左側(cè)異位卵巢、罕見(jiàn)卵泡和盆腔左側(cè)腎臟。
在從外周血白細(xì)胞中提取 DNA 并對(duì) WNT4 基因的四個(gè)外顯子進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 擴(kuò)增后，生殖科基因檢測(cè)組進(jìn)行了直接測(cè)序。 DNA 的基因檢測(cè)分析揭示了患者 1 中的新 WNT4 基因突變?；驒z測(cè)結(jié)果在 ORF 的 697 位發(fā)現(xiàn)了雜合的鳥(niǎo)嘌呤到腺嘌呤取代（c.697G> A），導(dǎo)致 WNT4 蛋白序列中的 p.A233T 取代.
WNT4 通過(guò) WNT/β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定途徑專(zhuān)門(mén)參與兩性生殖道發(fā)育和雌性胚胎中性腺組織的分化。為了確定 WNT4 突變參與觀察到的子宮發(fā)育不全，女性生殖障礙基因檢測(cè)組轉(zhuǎn)染突變型、野生型 (WT) 或兩者的組合后量化了 OVCAR3 細(xì)胞核中的 β-連環(huán)蛋白。當(dāng)突變體 p.A233T WNT4 在 OVCAR3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，β-連環(huán)蛋白的量顯著減少（P=0.0171）。在單獨(dú)用突變體 WNT4 或與等摩爾量的 WT 蛋白組合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，來(lái)自這些細(xì)胞的核裂解物中的 β-連環(huán)蛋白的量減少。這表明信號(hào)通路減弱，因?yàn)榻?jīng)典 WNT 信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活導(dǎo)致 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定。實(shí)際上，雌性 Wnt4-null 小鼠不能發(fā)育苗勒管，而沃爾夫管是穩(wěn)定的。 WNT4 轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制通過(guò) β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化發(fā)揮作用，其參與苗勒管的發(fā)育。 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化的體外研究證實(shí)了這種突變與人類(lèi)苗勒管發(fā)育不全有關(guān)。在基因解碼過(guò)程中，WNT4 突變體不能穩(wěn)定 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，并且至少需要 3 倍過(guò)量的 WT 構(gòu)建體來(lái)克服突變體效應(yīng)。與其他報(bào)道的突變一樣，這表明 WNT4 p.A233T 突變體具有顯性負(fù)效應(yīng)。
為了研究突變的功能意義，生殖科基因檢測(cè)研究組在人卵巢腺癌細(xì)胞系 NIH:OVCAR3 (ATCC HTB-161) 中表達(dá)了 WT 和突變體 WNT4 cDNA，并分析了 WNT4 變體對(duì)類(lèi)固醇生成酶表達(dá)和活性的影響，如先前報(bào)道的那樣。 mRNA 水平分析（實(shí)時(shí)定量 PCR 和逆轉(zhuǎn)錄 PCR 定性 mRNA 測(cè)定）顯示 WT 對(duì) CYP17A1 mRNA 有良好的抑制作用，但 p.A233T 突變的 WNT4 單獨(dú)或與 WT 組合沒(méi)有抑制作用。當(dāng)分析 HSD3B2 時(shí)，觀察到這種 WT 對(duì) mRNA 表達(dá)的抑制。令人驚訝的是，p.A233T WNT4 突變體能夠正確抑制 HSD3B2 mRNA 的表達(dá)。
然后通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)染 WNT4 并以 100 nmol/L 孕烯醇酮作為前體后卵巢細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌的類(lèi)固醇的量來(lái)評(píng)估這些酶的活性。 WT WNT4 降低了 17-羥基孕酮 (17OHP)、DHEA 和雄烯二酮的含量。正如預(yù)期的那樣，突變體 p.A233T WNT4 未能減少 DHEA 的產(chǎn)生，而它仍然能夠減少 17OHP 和雄烯二酮的產(chǎn)生。為了證實(shí)對(duì) mRNA 類(lèi)固醇生成酶的部分抑制，生殖科基因檢測(cè)通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)染 WT 或突變體 WNT4 和 100 nmol/L DHEA（測(cè)試 HSD3B2）或孕酮（測(cè)試CYP17A1）作為前體。該突變體能夠減少DHEA產(chǎn)生的雄烯二酮，而它失去了減少黃體酮產(chǎn)生17OHP的能力。
在 Wnt4 缺陷的雌性小鼠中，參與睪酮生物合成的兩種關(guān)鍵酶 3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶和 CYP17A1 的過(guò)表達(dá)強(qiáng)烈支持卵巢的部分男性化。 WNT4 似乎阻止了胎兒卵巢中的 Leydig 細(xì)胞分化。關(guān)于先前報(bào)道的三例 WNT4 突變女孩，細(xì)胞內(nèi)模型中 CYP17A1 和 HSD3B2 的不適當(dāng)表達(dá)支持 WNT4 在類(lèi)固醇生成酶表達(dá)中的抑制作用，這已通過(guò)臨床高雄激素血癥和受影響患者的血漿雄激素水平升高得到證實(shí).然而，這里報(bào)道的病例與那三例與高雄激素血癥相關(guān)的非典型 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) 綜合征略有不同，因?yàn)?HSD3B2 的 mRNA 表達(dá)改變與 CYP17A1 不同。事實(shí)上，p.A233T WNT4 突變體不能抑制 CYP17A1 的表達(dá)，而 HSD3B2 的抑制作用得以維持。這是先進(jìn)次觀察到 WNT4 突變體對(duì)特定類(lèi)固醇生成酶的抑制作用?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明 WNT4 突變導(dǎo)致雄激素合成酶的特定調(diào)節(jié)，并且表型數(shù)據(jù)可能與基因型相關(guān)。
其他三個(gè)具有相同表型（苗勒管發(fā)育不全和雄激素過(guò)多癥）的青春期女孩沒(méi)有 WNT4 突變強(qiáng)烈表明可能涉及 WNT4/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的其他成分。已知 WNT 分泌的蛋白質(zhì)與 Frizzled 家族的受體結(jié)合，啟動(dòng)至少三個(gè)導(dǎo)致細(xì)胞行為基因表達(dá)調(diào)節(jié)和/或變化的細(xì)胞內(nèi)途徑。經(jīng)典途徑涉及來(lái)自低密度脂蛋白受體家族 (LRP6) 的輔助受體，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定。 β-連環(huán)蛋白是一種多功能蛋白，可作為進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。然而，它通過(guò)由腺瘤性結(jié)腸息肉 (APC) 和軸蛋白組成的復(fù)合物磷酸化后被泛素化迅速降解，這促進(jìn)了酪蛋白激酶 1 和糖原合酶激酶 3 (GSK3) 對(duì) β-連環(huán)蛋白的磷酸化。 WNT 蛋白與表面受體的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活化，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)蓬亂時(shí)，反過(guò)來(lái)使破壞復(fù)合物失活，使 β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在沒(méi)有 WNT4 結(jié)合的情況下，不會(huì)發(fā)生 β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)的改變。當(dāng)未檢測(cè)到 WNT4 異常時(shí)，這種 WNT 信號(hào)通路的改變可能與 MRKH 綜合征的雄激素過(guò)多癥有關(guān)。 賊近的研究報(bào)告沒(méi)有 WNT4 基因突變，但這可能是因?yàn)檎心剂藳](méi)有高雄激素血癥臨床或生物學(xué)證據(jù)的患者。佳學(xué)基因重新審視了 MRKH 綜合征的分類(lèi)和廣泛的 MRKH 亞型。與高雄激素血癥相關(guān)的非典型 MRKH 綜合征被認(rèn)為屬于苗勒管發(fā)育不全的譜系。鑒于其非常典型的特征和 Biason-Lauber 工作所提供的進(jìn)步，佳學(xué)基因建議將這種特殊的 MRKH 表型稱為 Biason-Lauber 綜合征
