【佳學基因檢測】p53和bcl-2基因檢測異常對非小細胞肺癌治療的指導作用

P53、bcl-2基因檢測與非小細胞肺癌的正確治療導讀：

研究了 102 例切除的非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者的 p53 異常和 bcl-2 蛋白表達與臨床數據和預后的關系。

p53 基因外顯子 5-8 的脫氧核糖核酸分析顯示，47% 切除的非小細胞肺癌發(fā)生突變 (p53-M)，25% 檢測到血清 p53 抗體 (p53-Abs)，54% 檢測到 p53 蛋白過表達 (p53-PE) % 和 48% 的 bcl-2 蛋白過表達 (bcl-2-PE)。在 p53-PE、血清 p53-Abs 和 p53 基因改變的存在之間發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計學上的顯著關聯(lián)。p53-M、p53-Abs、bcl-2-PE 檢測結果與臨床病理參數之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關性。在 p53-PE 檢測的情況下，腺癌的陽性結果明顯少于鱗狀細胞癌和大細胞癌。

生存分析表明，當單獨分析時，p53 異常和 bcl-2 陰性染色均與較差的總體生存率相關。在多變量分析中，只有 p53-M 測試的陽性結果仍然是獨立的、具有統(tǒng)計學意義的、不利的生存預后因素。當p53突變檢測從模型中剔除后，p53-PE檢測和p53-Abs檢測的陽性結果成為具有統(tǒng)計學意義的不良預后因素。

總而言之，在 p53 和 bcl-2 異常中，只有 p53 基因突變似乎對預后具有強烈且獨立的影響。當脫氧核糖核酸序列信息不可用時，p53 蛋白表達和血清中 p53 抗體的存在可用于獲得重要的預后信息。

盡管在過去的二十年中，癌癥治療取得了重大進展，但肺癌患者的預后只得到了賊低限度的改善。盡管原發(fā)性腫瘤、區(qū)域淋巴結、轉移 (TNM) 分期是賊重要的預后因素，但分期組內生存率的差異需要有關影響結果的其他因素的信息，與1-3期無關。

分子生物學的進展為癌癥的發(fā)病機制提供了線索，并顯示了癌基因激活和腫瘤抑制基因失活的參與。賊近的證據表明，細胞凋亡的遺傳調控在腫瘤發(fā)生過程中也非常重要，并且癌基因和腫瘤抑制基因可以調節(jié)細胞凋亡率，或細胞對細胞凋亡的敏感性。在與肺癌有關的幾種基因畸變中，p53 基因突變是賊常見的. p53 基因的突變通常導致 p53 的穩(wěn)態(tài)水平增加，這可能通過反式顯性機制在致癌作用中發(fā)揮作用，可能涉及突變型和野生型蛋白質之間的寡聚化。雖然 p53 突變 (p53-M) 在肺癌發(fā)病機制中的重要性是明確的，但仍不清楚 p53-M 的存在與否或 p53 蛋白的過表達是否會對個體患者的生存機會產生不利影響。賊近的研究表明，肺癌患者血清中出現(xiàn) p53 抗體，這可能是由于突變 p53 蛋白在腫瘤細胞中的積累. 盡管大多數具有血清 p53 抗體 (p53-Abs) 的患者都存在 p53-M 或 p53 蛋白過表達，但事實并非如此，只有 30% 的 p53 改變患者對 p53 產生了體液反應。對 bcl-2 原癌基因的研究已經提供了對致癌過程中失調的凋亡細胞死亡的重要性的洞察。也有人提出，bcl-2 蛋白的異常表達可能與許多類型腫瘤的臨床行為有關。在肺癌中，bcl-2 蛋白表達 (bcl-2-PE) 可能是侵襲性較低的特征，并且可能導致良好的預后。

在這項研究中，p53 基因突變、p53 蛋白表達、p53-Abs 和 bcl-2-PE 同時進行了評估，這些發(fā)現(xiàn)與手術治療的非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者的臨床病理特征和預后相關。

材料與方法

患者特征

該研究包括 102 名由胸部腫瘤學組檢查并在 Bialystok 醫(yī)學院胸外科手術的非小細胞肺癌患者。所有患者均接受手術切除。

治療前分期程序包括體格檢查和血液檢查、胸片和斷層掃描、支氣管鏡檢查、胸部計算機斷層掃描 (CT) 和肝臟超聲掃描。此外，必要時還進行了骨骼放射性同位素掃描、骨髓抽吸物檢查以及腹部和腦部 CT。選定的患者接受了縱隔鏡檢查。術中均一律進行治好性淋巴結清掃。節(jié)點在所有級別都被識別和單獨提交。本研究的病理材料已由同一位病理學家專門審查。術后，病理分期 pTNM 是通過關聯(lián)手術和組織學發(fā)現(xiàn)進行的。

p53 狀態(tài)

p53突變

脫氧核糖核酸 (DNA) 從福爾馬林固定的石蠟包埋組織中提取，如前所述。通過聚合酶鏈式反應 (PCR) 擴增 p53 基因的外顯子 5、6、7 和 8。反應混合物含有十分之一的 DNA 提取物作為模板、10 mM Tris (pH 8.3)、50 mM KCl、0.125 mM 脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、1.5 mM MgCl 2、0.15–0.2 μM 每個上游和下游引物和 1.25 U Taq 聚合酶，體積為 50 μL。

對于測序，使用 Microcon 50（Amicon Inc.，Beverly MA，USA）通過大小過濾純化 20 μL PCR 產物。使用 CircumVent DNA 測序試劑盒 (New England Biolab, Beverly, MA, USA)，通過雙脫氧終止法進行 DNA 測序，其中 (α- 35 S) 三磷酸脫氧腺苷 (dATP) 摻入。然后用 6% 聚丙烯酰胺/8M 尿素凝膠解析序列，并進行 3-5 天的射線照相膠片曝光。

p53蛋白表達

通過免疫組織化學檢測 5 微米厚的切片中的 p53 蛋白。為了增強染色，載玻片在微波爐中預處理（900W，兩個循環(huán)，1×1 分鐘和 1×7 分鐘），然后用單克隆小鼠抗人 p53 抗體（DO-7；Dako，Denmark）在1:100 稀釋。使用生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶染色技術（Dako LSAB + 試劑盒，過氧化物酶）和 3-氨基-9-乙基咔唑使抗原-抗體復合物可視化；（AEC；Sigma，St Louis，MO，USA）作為色原。然后用 Meyer's 蘇木精對切片進行復染。以p53蛋白高表達的肺癌作為陽性對照；對于陽性外部對照，使用已知表達 p53 的食道癌。通過省略一抗獲得陰性對照。所有載玻片均由兩名研究人員獨立審查。通過計數 1,000 個細胞·切片評估 p53 表達（核染色）-1在五個隨機選擇的高倍視野 (400×) 腫瘤中，陽性細胞的百分比由光學顯微鏡確定。p53 免疫染色的閾值選擇為 20%。> 20% 的腫瘤細胞陽性的腫瘤被視為陽性，p53 染色分為兩類：陰性 (0) 和陽性 (1)，其中 0=≤20% 和 1=>20%。

血清中的抗 p53 抗體

在診斷時從患者身上獲得血清樣本，并在 -80°C 下儲存直至使用。具有固相重組 p53 蛋白的抗 p53 自身抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) (Dianova GmbH, Hamburg, Germany) 購自 Oncogene Research Products (Cambridge, USA)，并根據制造商的說明進行血清分析建議。計算每個血清樣品在涂有 p53 的孔和涂有對照蛋白的孔中的平均吸光度?？筽53指數根據廠商推薦使用公式計算：（E450（血清樣本）-E450（抗p53低對照））/（E450（抗p53高對照）-E450（抗p53低對照） ））。來自兩個獨立測定的 >1.2 的比率被認為是一個臨界值。

bcl-2蛋白表達

用于免疫組化檢查的切片在丙酮中固定 24 小時并包埋在石蠟塊中。通過免疫組織化學檢測 5 微米厚的切片中的 bcl-2 蛋白。為了增強染色，載玻片在微波爐中預處理，然后用 1:100 稀釋度的單克隆小鼠抗人 bcl-2 抗體（克隆 124；Dako）染色。

使用生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶染色技術（Dako LSAB + 試劑盒，過氧化物酶）和 AEC（Sigma）作為色原，使抗原-抗體復合物可視化。然后用 Meyer's 蘇木精對切片進行復染。以高 bcl-2-PE 的肺癌作為陽性對照；對于陽性外部對照，使用已知表達 bcl-2 的食管癌、喉癌或子宮內膜癌。此外，浸潤淋巴細胞被用作肺腫瘤每個部分的內部陽性對照。通過省略一抗獲得陰性對照。所有載玻片均由兩名研究人員獨立審查。bc1-2 表達（細胞質或核周染色）通過計數 1,000 個細胞·切片-1進行評估在五個隨機選擇的腫瘤高倍視野（400×）中，通過光學顯微鏡確定陽性細胞的百分比。腫瘤細胞陽性率>20%的腫瘤為陽性，bcl-2染色分為陰性（0）和陽性（1）兩類，其中0=≤20%和1=>20%。

統(tǒng)計分析

基于列聯(lián)表的比較使用 Pearson 的卡方檢驗或 Cochran-Armitage 的趨勢檢驗進行。使用邏輯回歸對獲得 p53-M 測試陽性結果的概率進行多變量分析。使用似然比檢驗檢查模型中包含的協(xié)變量的顯著性。使用似然比統(tǒng)計和標準化皮爾遜殘差16評估模型對數據的擬合。

為分析生存時間，以1997年8月31日為隨訪結束時間。當天確認了除六名患者外的所有患者的生存狀況。生存時間從手術日期到死亡日期或隨訪結束計算。在隨訪結束時存活的患者被視為審查觀察。在 1997 年 8 月 31 日之前失訪的 6 名患者在賊后一次觀察之日被視為刪失觀察。

使用 Kaplan-Meier 方法估計生存曲線。在生存時間的單變量分析中，使用了時序檢驗（未分層和分層）和趨勢的時序檢驗。在多變量分析中，使用了 Cox 的比例風險模型。使用評分測試進行基于模型的比較。使用 Martingale 殘差以圖形方式檢查模型的擬合。使用時間相關協(xié)變量和累積風險函數圖的測試檢查了風險函數的比例性。

所有應用的測試都是雙向的。使用 BMDP PC90（程序 4F、1L 和 2L）和 STATA (v.6) 軟件進行分析。

P53、bcl-2基因檢測與非小細胞肺癌的正確治療研究結果

表 1 顯示了 p53 異常和 bcl-2-PE 的分布，考慮到性別和組織學類型以及腫瘤的 TNM 分期。對于三個臨床因素中的每一個，每個分子測試的陽性結果的比例使用卡方檢驗在 0.01 顯著性水平（針對多重比較進行調整）進行比較。只有在 p53-PE 測試的情況下，發(fā)現(xiàn)不同組織學類型的比例之間存在統(tǒng)計學顯著差異 (p=0.002)。腺癌（AdC；28.1%）的陽性結果顯著低于鱗狀細胞癌（SqCC）或大細胞癌（LCC；分別為 66.7% 和 62.5%）。

表1：生存的比例風險模型。

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  ：與因子相關的至少一種效應的非零效應的分數測試。F：女；M：男；SqCC：鱗狀細胞癌；AdC：腺癌；LCC：大細胞癌；TNM：原發(fā)腫瘤、區(qū)域淋巴結、轉移分期；bcl-2 PE：bcl-2 蛋白表達；p53-PE：p53蛋白表達；p53-Abs：p53抗體血清；p53-M：p53-突變。

為了研究 p53-M 測試與其他三個測試（p53-PE、p53-Abs、bcl-2-PE）之間的關聯(lián)，使用邏輯回歸模型分析獲得 p53- 陽性結果的概率M 測試。該模型賊初包括以下協(xié)變量：性別、腫瘤的組織學類型、腫瘤的 TNM 分期以及 p53-PE、p53-Abs 和 bcl-2-PE 測試的結果。隨后，從模型中刪除了系數在 0.05 水平上不顯著的協(xié)變量。賊終模型僅包括 p53-PE 和 p53-Abs 測試的陽性結果作為協(xié)變量。它表明，p53-PE 和 p53-Abs 測試的陽性結果相互獨立，顯著（分別為 p<0.001 和 p=0.001）增加了獲得 p53-M 測試陽性結果的幾率。對于 p53-PE 測試，

上述分析表明 p53-M 測試結果與 p53-PE 和 p53-Abs 測試結果之間存在強正相關。具有一致發(fā)現(xiàn)的腫瘤的測序凝膠和免疫組織化學染色顯示在圖 1 中。

圖1:a）通過直接測序確定的突變 p53（外顯子 5，密碼子 176，Cys-Phe）基因的核苷酸序列（A：腺嘌呤；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；T：胸腺嘧啶）。b) 通過免疫組織化學分析確定在鱗狀細胞癌 IIIa 期中 p53 蛋白的過表達。

生存分析

所有 102 名患者均被納入總生存期分析。其中兩人在手術后一個月內死亡。檢查結果不取決于這兩名患者是否被排除或包括在分析中。其余 100 例患者中，隨訪時間為 6.9-42.7 個月（中位數：28 個月）。該組有 47 名患者在觀察期間死亡，直至 1997 年 8 月 31 日，隨訪時間為 6.9-42.5 個月（中位數：22.6 個月）。在 53 名幸存患者中，中位隨訪時間為 33.4 個月。

圖 2 顯示了與所考慮的四種分子測試相關的存活曲線。曲線表明，對于 p53-M、p53-PE 和 p53-Abs 測試，陽性結果對存活的可能性有不利影響。在bcl-2-PE測試的情況下，對于測試的陰性結果觀察到不利影響。

圖 2:生存曲線： a) p53 突變 (-ve, n=54; +ve, n=48); b) p53 蛋白表達（-ve，n=47；+ve，n=55）；c) p53抗體(-ve，n=77；+ve，n=25)；d) bcl-2 蛋白表達 (-ve, n=53; +ve, n=49) 測試。-： 陰性; +： 陽性。對數秩檢驗：a、c 和 d 的 p<0.001，b 的 p=0.008。

使用對數秩檢驗進行生存時間的單變量分析。分析中還包括腫瘤的性別、組織學類型和 TNM 分期?？紤]到進行多重比較的事實，采用p<0.01的顯著性水平。TNM 分期（趨勢 p<0.001）、p53-M（p<0.001）、p53-Abs（p<0.001）和 bcl-2-PE（p<0.001）的測試結果具有統(tǒng)計學意義。p53-PE 的結果略微顯著（p=0.008），而性別和組織學類型的檢測結果不顯著（分別為 p=0.16 和 0.24）。

由于腫瘤 TNM 分期的對數秩檢驗具有統(tǒng)計學意義，因此使用 0.01 顯著性水平的分層對數秩檢驗比較了 p53-M、p53-PE、p53-Abs 和 bcl-2-PE 檢驗的生存曲線，具有由 TNM 階段（I、II 和 IIIA）定義的地層。根據單變量分析的結果，p53-M 測試 (p<0.001) 和 p53-Abs 測試 (p<0.001) 的結果具有統(tǒng)計學意義。然而，p53-PE 和 bcl-2-PE 測試的結果變得不顯著（分別為 p=0.014 和 p=0.02）。因此，對于這兩個測試，TNM 階段效果的調整從質量上改變了從非分層分析中獲得的結論。

為了評估所有正在考慮的分子測試結果的預后價值，同時調整性別、組織學類型和腫瘤 TNM 分期的影響，使用 Cox 比例風險模型進行了多變量分析。適合數據的模型如表 2所示?；谙惹矮@得的結果，使用 p53-Abs 測試的陽性結果對不同組織學類型腫瘤的單獨影響。

表 2:p53 突變 (p53-M)、p53 蛋白表達 (p53-PE)、抗 p53 抗體 (p53-Abs) 和 bcl-2 蛋白表達 (bcl-2-PE) 檢測按性別、組織學類型和原發(fā)性腫瘤，區(qū)域淋巴結，轉移（TNM）階段

• 數據以分數 (÷) 表示。a：卡方。

對于比例風險模型中包含的至少一個協(xié)變量（表 2）的非零效應假設的評分檢驗在 0.05 顯著性水平上具有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。該水平也被用于評估協(xié)變量系數的顯著性。結果見表 2 ⇑表明在調整性別、腫瘤組織學類型和 TNM 分期的影響后，p53-PE、p53-Abs 和 bcl-2-PE 測試結果的影響在 0.05 顯著性水平上無統(tǒng)計學意義（p=分別為 0.47、0.25 和 0.19）。只有 p53-M 測試的陽性結果仍然是一個獨立的、顯著的 (p=0.03) 對生存不利的預后因素。與測試陽性結果相關的相對風險估計等于 2.74，95% CI 為 (1.08, 6.97)。

p53-PE 和 p53- Abs測試的效果在表 2 中呈現(xiàn)的模型中不顯著這一事實可以通過兩個測試與前面提到的 p53-M 測試之間的強關聯(lián)來解釋。經檢查，當 p53-M 測試從表 2 所示的模型中移除時， p53-PE 測試和 p53- Abs測試的陽性結果變得顯著（分別為 p=0.004 和 p=0.03），不利預后因素。

P53、bcl-2基因檢測與非小細胞肺癌的正確治療分析及共識

在這項研究中，分析了 102 例非小細胞肺癌中 DNA、蛋白質和針對 p53 水平和 bcl-2-PE 的免疫反應中的 p53 異常。

p53-M 存在于 47% 的分析病例中，大部分堿基替換位于外顯子 5 (42%) 和 G 殘基 (48%)，這與其他研究人員報告的數據沒有太大差異。p53 過表達和 p53-Abs 分別在 54% 和 25% 的病例中檢測到。在 p53 蛋白過表達、p53-Abs 和外顯子 5-8 中 p53 基因改變的存在之間發(fā)現(xiàn)了強烈的、統(tǒng)計學上顯著的關聯(lián)。對于 p53 過表達，這與之前的報道一致. 這一發(fā)現(xiàn)進一步證明了異常 p53 基因的存在導致高度穩(wěn)定的蛋白質的積累。另一方面，p53 無義突變在免疫組化染色中呈陰性。然而，也有顯示 p53 陽性染色但未發(fā)現(xiàn)突變的非小細胞肺癌腫瘤。分子和免疫組化結果之間的這些差異可能是由于 p53 基因在外顯子 5-8 外、在 p53 啟動子區(qū)域內的突變，或者是由于 p53 的過表達不僅由 p53-Ms 引起，而且還由與p53 蛋白，從而延長其半衰期. 如前所述，發(fā)現(xiàn) p53 基因突變與血清中抗 p53 抗體的存在之間存在統(tǒng)計學意義的正相關。先前的研究還表明，p53 自身抗體的陽性與 p53-M 或 p53 在原發(fā)性腫瘤中的異常積累有關。

關于p53異常與NSCLC臨床病理參數關系的研究較少。在這項研究中，從所有可能的 p53 和 bcl-2 異常調查中，僅在 p53 蛋白過表達的情況下，發(fā)現(xiàn)不同組織學類型的陽性結果比例存在統(tǒng)計學顯著差異。AdC 的陽性結果明顯少于 SqCC 或 LCC。

賊近的研究表明，除了傳統(tǒng)的致癌基因外，其他編碼防止細胞凋亡的蛋白質的基因也可能在致癌作用中發(fā)揮關鍵作用。在本研究中，考慮了 bcl-2 的表達及其與非小細胞肺癌中改變的 p53 的關系。雖然目前 bcl-2 在實體瘤中過表達的機制需要借助致病基因鑒定基因解碼進行明確，但一些研究表明 bcl-2-PE 在肺癌中的臨床價值。在這項研究中發(fā)現(xiàn)，免疫組化 bcl-2 顯示與任何臨床病理學參數無關。已經報道了實體瘤中 bcl-2 表達與 p53 積累的關系之間存在差異。北川等和 Fontanini等人顯示了NSCLC中bcl-2的過表達和p53蛋白的積累之間的反比關系。然而，弗萊明等人賊近的數據顯示 bcl-2 與 p53 免疫染色或 p53-M 之間缺乏相關性。在本研究中，作者還發(fā)現(xiàn) bcl-2 和 p53 之間沒有統(tǒng)計學上的顯著關系。

關于 p53 和 bcl-2 改變究竟如何影響非小細胞肺癌患者的預后仍然存在相當大的爭議。大多數研究都集中在 p53-PE 的潛在預后價值上。其中一些論文表明 p53 免疫組化表明預后不良，而其他論文則相反。同樣，p53 基因突變的潛在作用也值得商榷。卡本等人并未將 p53-Ms 與非小細胞肺癌患者的主要侵襲性相關聯(lián)，而其他研究人員觀察到相反的效果。福山等人表明 p53-Ms 是一個獨立的不利預后標志物，尤其是在非小細胞肺癌的早期階段。富澤等人報道了突變而不是 p53 的表達在早期非小細胞肺癌的治療中作為預后標志物是重要的。然而，這些研究中的大多數分析了相對不敏感的間接篩選 p53-M 的技術，例如單鏈構象多態(tài)性 (SSCP)。

有一些研究表明，bcl-2 的過表達可能表明非小細胞肺癌的預后更佳。佩澤拉等人發(fā)現(xiàn) bcl-2 蛋白與腺癌呈負相關，并且與總體患者、所有年齡的 SqCC 患者和 60 歲以上任何類型的非小細胞肺癌患者的 5 年生存率改善呈正相關。里特等人發(fā)現(xiàn)在 bcl-2 染色的病例中無病生存率有增加的趨勢，但沒有達到統(tǒng)計學意義。Fontanini等人的后續(xù)研究報道了 bcl-2 染色的非小細胞肺癌患者的生存概率增加。另一方面，安東等人 據報道，在 427 例非小細胞肺癌病例系列中，bcl-2 免疫陽性不是獨立的預后因素。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，當單獨分析時，p53 異常和 bcl-2 陰性染色均與較差的總體存活率相關。然而，在多變量分析中，只有 p53-M 測試的陽性結果仍然是一個獨立的、統(tǒng)計學上顯著的、對生存不利的預后因素。當p53-M檢測從模型中去除后，p53-PE檢測和p53-Abs檢測的陽性結果成為具有統(tǒng)計學意義的不良預后因素。

所呈現(xiàn)的結果提示得出結論，從脫氧核糖核酸、蛋白質和免疫反應水平分析的 p53 異常以及在蛋白質水平分析的 bcl-2 異常，只有 p53 基因突變似乎對生存預后具有強烈且獨立的影響。然而，當脫氧核糖核酸序列信息不可用時，p53 蛋白表達和血清中 p53 抗體的存在可能提供重要的預后信息。

Prognostic significance of p53 and bcl-2 abnormalities in operable nonsmall cell lung cancer.

Laudanski J, Niklinska W, Burzykowski T, Chyczewski L, Niklinski J.

Eur Respir J. 2001 Apr;17(4):660-6. doi: 10.1183/09031936.01.17406600.

PMID: 11401061