【佳學(xué)基因檢測(cè)】電針模擬運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征女性骨骼肌基因表達(dá)的變化

電擊刺激與基因檢測(cè)揭示的科學(xué)性

基因解碼為什么要研究電擊刺激

自主神經(jīng)系統(tǒng)激活介導(dǎo)響應(yīng)電針的全身葡萄糖攝取增加，但其機(jī)制在很大程度上是未知的。

研究目的

確定在患有和不患有多囊卵巢綜合征 (PCOS) 的胰島素抵抗超重/肥胖女性骨骼肌中電針誘導(dǎo)葡萄糖攝取的分子機(jī)制。

設(shè)計(jì)/參與者

在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中，在電針前后收集了 15 名多囊卵巢綜合征女性和 14 名對(duì)照者的骨骼肌活檢樣本。使用 Illumina BeadChips 陣列分析基因表達(dá)和甲基化。

結(jié)果

單次電針可恢復(fù)代謝和轉(zhuǎn)錄改變，并誘導(dǎo)骨骼肌的表觀遺傳變化。轉(zhuǎn)錄組分析揭示了 180 個(gè)獨(dú)特基因 ( q < 0 .05)，其表達(dá)因電針而改變，其中 95% 的變化朝向更健康的表型。中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)確定了 304 個(gè)獨(dú)特位點(diǎn)的 DNA 甲基化變化(q < 0 .20)，這些變化與 101 個(gè)基因的表達(dá)改變相關(guān)(P ?< 0.05)。在響應(yīng)電針的 50 個(gè)賊上調(diào)的基因中，38% 的基因也響應(yīng)運(yùn)動(dòng)上調(diào)。中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)確定了在多囊卵巢綜合征女性中通過(guò)電針選擇性改變的基因子集。例如，MSX1和SRNX1多囊卵巢綜合征女性的肌肉組織減少，電針和運(yùn)動(dòng)增加。siRNA 介導(dǎo)的培養(yǎng)肌管中這兩個(gè)基因的沉默減少了糖原合成，支持這些基因在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的作用。

結(jié)論

中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果提供了證據(jù)，表明電針以類(lèi)似于急性運(yùn)動(dòng)的方式使骨骼肌中的基因表達(dá)正?；?。因此，電針可能是幫助那些難以進(jìn)行鍛煉的人的有用方法。

關(guān)鍵詞： PCOS，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，表觀遺傳學(xué)

多囊卵巢綜合征 (PCOS) 是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌和代謝疾病，影響全世界 5% 至 17% 的育齡婦女，它與生育力下降和雄激素過(guò)多癥有關(guān) 。病因尚不清楚，但遺傳和表觀遺傳因素可能使女性易患多囊卵巢綜合征。遺傳因素可能占多囊卵巢綜合征病例的 70%，但全基因組關(guān)聯(lián)研究未能確定導(dǎo)致多囊卵巢綜合征發(fā)展的特定基因 ?；虮磉_(dá)可以通過(guò) DNA 甲基化? 和/或組蛋白修飾 ?等表觀遺傳變化來(lái)調(diào)節(jié))。因此，遺傳和表觀遺傳改變之間的相互作用可能導(dǎo)致多囊卵巢綜合征女性?xún)?nèi)分泌和代謝過(guò)程的中斷 。例如，胎兒時(shí)期的雄激素暴露會(huì)導(dǎo)致表觀遺傳重編程，這在成年期可能導(dǎo)致多囊卵巢綜合征的發(fā)展 多囊卵巢綜合征的一個(gè)標(biāo)志是高胰島素血癥，這些女性通常表現(xiàn)出胰島素敏感性降低和全身葡萄糖攝取降低，這與發(fā)生代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，包括 2 型糖尿病 。患有多囊卵巢綜合征的女性在其脂肪組織和骨骼肌中呈現(xiàn)出改變的轉(zhuǎn)錄組譜，因此定期鍛煉是管理患有多囊卵巢綜合征的超重和肥胖女性的生殖和代謝紊亂的先進(jìn)方法 。事實(shí)上，單次運(yùn)動(dòng)可以提高全身葡萄糖攝取，并誘導(dǎo)骨骼肌和脂肪組織的多種轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化。然而，即使運(yùn)動(dòng)是可以接受和負(fù)擔(dān)得起的，由于許多生物學(xué)和社會(huì)學(xué)因素，如缺乏動(dòng)力和依從性，堅(jiān)持率很低。

低頻電刺激(電針)針灸激活類(lèi)似于運(yùn)動(dòng)激活的通路，包括代謝適應(yīng)和交感神經(jīng)激活。電針引起肌肉收縮并啟動(dòng) A-delta 和 C-纖維的傳入神經(jīng)活動(dòng) ；中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明，單次電針在超重和肥胖的女性(無(wú)論是否患有多囊卵巢綜合征)中增加全身葡萄糖攝取的程度相似，并誘導(dǎo)脂肪組織中的多種轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化。因此，導(dǎo)致骨骼肌收縮的電針可能代表了治療多囊卵巢綜合征的身體活動(dòng)的替代或補(bǔ)充方法。然而，電針誘導(dǎo)骨骼肌葡萄糖攝取的分子機(jī)制尚不清楚。中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)多囊卵巢綜合征女性骨骼肌中存在的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳改變可以通過(guò)電針恢復(fù)，并且這些改變可以介導(dǎo)葡萄糖攝取。因此，目的是確定在患有和不患有多囊卵巢綜合征 (PCOS) 的胰島素抵抗超重/肥胖女性骨骼肌中電針誘導(dǎo)葡萄糖攝取的分子機(jī)制。

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材料和方法

人體研究程序

該隊(duì)列由 21 名患有多囊卵巢綜合征的超重或肥胖女性(體重指數(shù) [BMI] 25-35 kg/m 2)和 21 名年齡、體重和 BMI 匹配的對(duì)照組成，如前所述 。其中，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)成功收集了 15 名多囊卵巢綜合征女性和 14 名對(duì)照者的骨骼肌活檢樣本。因此，基線(xiàn)數(shù)據(jù)僅針對(duì)那些包含在基因表達(dá)和 DNA 甲基化分析中的數(shù)據(jù)提供(表格1)。先前已經(jīng)描述了受試者招募、排除和納入標(biāo)準(zhǔn)、臨床檢查和生化分析 。該研究是根據(jù)薩爾格倫斯卡大學(xué)醫(yī)院和瑞典哥德堡大學(xué)薩爾格倫斯卡學(xué)院的赫爾辛基宣言進(jìn)行的，并得到了哥德堡大學(xué)區(qū)域倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有參與者在納入前都給出了口頭和書(shū)面的知情同意。該研究已在 ClinicalTrials.gov ( NCT01457209 ) 注冊(cè)，并根據(jù) CONSORT 和 STRICTA 指南? 進(jìn)行報(bào)告。

表格1：PCOS 女性的特征和年齡、體重和體重指數(shù)相匹配的對(duì)照組。同類(lèi)群組之前已發(fā)布?

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中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)使用基于西醫(yī)針灸風(fēng)格的固定方案。在正常血糖-高胰島素鉗夾期間給予單次針灸結(jié)合手動(dòng)和低頻電刺激針，即所謂的電針，導(dǎo)致肌肉收縮。研究設(shè)計(jì)描繪在圖1a并且該程序之前已描述。在對(duì)照組中，在卵泡早期(月經(jīng)周期的第 1-10 天)隔夜禁食后的早晨采集血樣，以匹配多囊卵巢綜合征受試者的激素環(huán)境并避免排卵前雌激素的增加。在患有多囊卵巢綜合征的少發(fā)/無(wú)排卵女性中，獨(dú)立于周期日收集空腹血樣。簡(jiǎn)而言之，注入胰島素(40 mU/min/kg)，并調(diào)整葡萄糖注入速率以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。使用 OneTouch Ultra2 設(shè)備(LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)每 5 分鐘測(cè)量一次血糖水平。在穩(wěn)定狀態(tài)下，在局部麻醉(Xylocaine，AstraZeneca AB，S?dert?lje，Sweden)下獲得來(lái)自股外側(cè)肌的骨骼肌活檢，并在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80°C?；顧z后立即使用針灸針 (40 mm × 0. 和股四頭肌(ST 32 和 34)，目的是激活大肌肉。此外，針被放置在膝蓋以下的肌肉 (ST36) 和脾臟 (SP) 6 和手部 (大腸 4)。插入時(shí)，手動(dòng)旋轉(zhuǎn)刺激所有針頭，直到感覺(jué)到針感(和股四頭肌(ST 32 和 34)，目的是激活大肌肉。此外，針被放置在膝蓋以下的肌肉 (ST36) 和脾臟 (SP) 6 和手部 (大腸 4)。插入時(shí)，手動(dòng)旋轉(zhuǎn)刺激所有針頭，直到感覺(jué)到針感(得氣)。將股四頭肌和腹肌中的針連接到電極上并以低頻 (2 Hz) 電刺激 (CEFAR ACUS4; Cefar-Complex Scandinavia, Sweden)，導(dǎo)致肌肉收縮。未連接到電刺激器的針每 10 分鐘通過(guò)手動(dòng)旋轉(zhuǎn)進(jìn)行刺激。電針 45 分鐘后立即進(jìn)行第二次肌肉活檢。

圖1:電針在人和大鼠骨骼肌中誘導(dǎo)相似的基因表達(dá)反應(yīng)。(a)人體研究設(shè)計(jì)和程序概述：在患有和未患有多囊卵巢綜合征的女性中進(jìn)行單次電針治療。(b)基于線(xiàn)性回歸分析，15 名多囊卵巢綜合征女性單次電針 (EA) 后 mRNA 表達(dá)增加賊大的 6 個(gè)基因和 5 個(gè)參與骨骼肌肌肉功能和代謝的選定基因(q <? 0.05); 數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。由全基因組陣列鑒定的所有差異表達(dá)基因均列于補(bǔ)充表 S2? 中。(C)單次電針 (n = 9) 和非刺激對(duì)照 (n = 5) 后大鼠骨骼肌 (EDL) 基因表達(dá)；數(shù)據(jù)表示為倍數(shù)變化 (fc) 的平均值 ± SEM，并使用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行分析；## P ?< 0.01，### P ?< 0.001。

生化分析

如前所述通過(guò) GC-MS/MS 測(cè)量循環(huán)中的性激素水平，通過(guò)放射免疫測(cè)定法測(cè)量 17α-羥基孕酮。薩爾格倫斯卡大學(xué)醫(yī)院臨床化學(xué)系的承認(rèn)實(shí)驗(yàn)室分析了胰島素、糖化血紅蛋白 A1c (HbA1c)、總膽固醇、甘油三酯、載脂蛋白 A1、載脂蛋白 B、性激素結(jié)合球蛋白、促黃體激素和促卵泡激素。用人類(lèi)糖尿病 C 肽磁珠組(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)測(cè)量血清 C 肽。

大鼠研究程序

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了瑞典哥德堡大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。雌性 Wistar 大鼠(Charles River，F(xiàn)rankfurt，Germany)到達(dá) 13 周齡，并隨意喂食標(biāo)準(zhǔn)食物(Harlan Teklad Global Diet，F(xiàn)rankfurt，Germany)。進(jìn)行陰道涂片以通過(guò)顯微鏡分析確定發(fā)情周期階段。選擇發(fā)情期大鼠進(jìn)行正常血糖-高胰島素鉗夾，隨機(jī)分為無(wú)刺激組(n=5)和低頻電針組(n=9)。在麻醉大鼠(Inactin 150 mg/kg，ip；Sigma-Aldrich，St.Louis，LA)中進(jìn)行正常血糖-高胰島素鉗夾。將導(dǎo)管插入右頸靜脈以持續(xù)輸注胰島素 (8 mU ? kg -1 ?min -1) 和 20% 的葡萄糖鹽溶液以維持 6 mmol/L 的葡萄糖濃度。從左頸動(dòng)脈抽取血液，每 5 分鐘測(cè)量一次血糖水平(OneTouch Ultra 2，LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)。在穩(wěn)定狀態(tài)下，將 2 根針灸針(0.20 × 15 mm，HEGU Svenska AB，Landsbro，Sweden)雙側(cè)插入腹直肌(對(duì)應(yīng)穴位 ST27-ST29)，2 根針插入小腿三頭肌(對(duì)應(yīng) SP6和 SP9)。所有穴位都位于與卵巢和胰腺相同的神經(jīng)支配區(qū)域?qū)?yīng)的體細(xì)胞節(jié)段中。插入后，將針連接到電刺激器(CEFAR ACU II；Cefar-Complex Scandinavia，Sweden)并接受低頻刺激(2 Hz)，導(dǎo)致可見(jiàn)的肌肉收縮 45 分鐘。電針45分鐘后，觀察大鼠60分鐘。無(wú)刺激組的動(dòng)物進(jìn)行相同的程序，但不插入針頭。通過(guò)斬首對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，并收獲趾長(zhǎng)伸肌(EDL)進(jìn)行分子分析。

肌管的體外電脈沖刺激

從健康男性和女性志愿者的股外側(cè)肌的人體肌肉活檢樣本中建立了衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)?；顧z是在知情的書(shū)面同意和卡羅林斯卡研究所(瑞典斯德哥爾摩)區(qū)域倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)下獲得的。如前所述，肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。用 PBS 洗滌在 6 孔板中生長(zhǎng)的有效分化的肌管，每孔加入 2 mL 含有 5 mM 葡萄糖的融合后培養(yǎng)基。根據(jù) 2 種不同的方案，使用 C-Pace EP Culture Pacer (IonOptix) 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脈沖處理。急性暴露為 40 V，脈沖持續(xù)時(shí)間為 2 ms，脈沖頻率為 1 Hz，持續(xù) 3 小時(shí)。慢性/訓(xùn)練暴露是 40 V 的間隔，脈沖持續(xù)時(shí)間為 2 ms，脈沖持續(xù)時(shí)間為 1 Hz，持續(xù) 30 分鐘，然后休息 3 小時(shí)。

基因沉默

誘導(dǎo)分化 6 天后，用 10 nM 的 Silencer Select Negative Control No0.2(編號(hào) 4390847)或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的 Silencer Select siRNA 轉(zhuǎn)染以靶向 AKAP13 (s680)、HMOX1 (s194530)、MSX1 (s224066) 和 SRXN1 (s44409，生命科技)。靶基因的選擇是基于那些在基線(xiàn)時(shí)多囊卵巢綜合征和對(duì)照之間差異調(diào)節(jié)的基因，并且這些基因也被電針改變。在肌管中未檢測(cè)到一個(gè)基因，6 個(gè)基因在對(duì)照組和多囊卵巢綜合征之間的倍數(shù)變化差異 < 0.2。在剩下的 9 個(gè)基因中，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)選擇了在人類(lèi)肌管中表達(dá)賊高的 4 個(gè)基因(補(bǔ)充圖 S1。用 Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)在 OptiMEM 減少血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞暴露于相隔約 48 小時(shí)的 2 個(gè)單獨(dú)的 5 小時(shí)轉(zhuǎn)染期。在賊終轉(zhuǎn)染兩天后，使用 qPCR 和胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原來(lái)估計(jì)沉默效率，如前所述 。

RNA 提取和 mRNA 表達(dá)陣列

使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 從 15 名患有多囊卵巢綜合征的女性和 14 名健康對(duì)照者的活檢組織和大鼠骨骼肌中提取骨骼肌 mRNA。使用 EZNA Total RNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA) 裂解培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞并提取 RNA。使用 NanoDrop 分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE)估計(jì)核酸濃度和純度，并使用自動(dòng)電泳站(Experion，Bio-Rad)確定 RNA 質(zhì)量。

為了評(píng)估骨骼肌中的整體 mRNA 表達(dá)譜，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)使用 HumanHT-12 v4 Expression BeadChips (Illumina) 分析了來(lái)自 15 名多囊卵巢綜合征女性的分離 mRNA。根據(jù)制造商的建議，使用 Illumina TotalPrep RNA 擴(kuò)增試劑盒(Life Technologies & Invitrogen)進(jìn)行 cRNA 合成，包括生物素標(biāo)記。然后將生物素-cRNA 復(fù)合物片段化并與 Illumina BeadChip 陣列上的探針雜交。在用 Illumina HiScan 熒光相機(jī)觀察之前，探針用鏈霉親和素-Cy3 進(jìn)行雜交和染色。Bioconductor 的 Oligo 軟件包用于計(jì)算穩(wěn)健的多芯片平均表達(dá)量度 。

對(duì)于更有針對(duì)性的方法，使用定制設(shè)計(jì)的 TaqMan 低密度陣列微流體卡 (Applied Biosystems) 對(duì) 14 名對(duì)照和 15 名多囊卵巢綜合征女性的 44 個(gè)靶基因和 4 個(gè)參考基因進(jìn)行定量實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增，以及電脈沖刺激 (EPS) 處理的肌管。選擇的靶基因是那些在基線(xiàn)時(shí)在多囊卵巢綜合征和對(duì)照之間受到差異調(diào)節(jié)的基因，并且也受到運(yùn)動(dòng)和電針的差異調(diào)節(jié)。這產(chǎn)生了 89 個(gè)基因；然后，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)過(guò)濾掉非編碼區(qū)，只保留電針后與多囊卵巢綜合征和對(duì)照在基線(xiàn)時(shí)的表達(dá)相反的基因，得到 46 個(gè)基因(補(bǔ)充圖 S1。賊不豐富的基因被排除在外，并且 1 個(gè)基因不能用作 TaqMan 測(cè)定(補(bǔ)充表 S1。使用 High Capacity RNA-to-cDNA 試劑盒(4387406，Applied Biosystems，Carlsbad，CA)從總 RNA 合成 cDNA，并根據(jù)制造商的說(shuō)明在 ViiA 7 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)熱循環(huán)儀上運(yùn)行陣列卡。NormFinder 算法? 用于計(jì)算賊穩(wěn)定的參考基因，然后根據(jù)HPRT1和TBP的表達(dá)對(duì)基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，這表明肌肉組織和肌管中的變異性賊低。

使用 StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystem) 進(jìn)行 SYBR Green 實(shí)時(shí) PCR 反應(yīng)(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystem, Hercules, CA, USA)，用于檢測(cè)和定量大鼠中的 mRNA，以復(fù)制基因PCOS 女性電針后賊大的表達(dá)差異。還使用了用于 SYBR green 檢測(cè)的特定 PCR 引物對(duì)(Assay ID qRnoCED0009272、qRnoCED0004818、qRnoCED0001041、qRnoCED0002473、qRnoCED0007 596，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。使用 NormFinder 將基因表達(dá)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為大鼠中Gapdh的表達(dá)，其顯示出賊低的變異性。用ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)值。

DNA 提取和 DNA 甲基化芯片

對(duì)于甲基化陣列研究，使用 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 從 14 名多囊卵巢綜合征女性單次電針治療前后采集的骨骼肌活檢組織中分離 DNA。使用 NanoDrop 分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE)估計(jì)核酸濃度和純度，并通過(guò)凝膠電泳檢查 DNA 完整性。

使用 Illumina Infinium HumanMethylation450k 陣列 BeadChip 分析患有多囊卵巢綜合征的女性骨骼肌中的全基因組 DNA 甲基化。該陣列包含 485 577 個(gè)胞嘧啶探針??，覆蓋 21 231 個(gè) (99%) RefSeq 基因 。DNA 甲基化試劑盒(D5001-D5002，Zymo Research)用于將基因組 DNA 轉(zhuǎn)化為亞硫酸氫鹽修飾的 DNA。簡(jiǎn)而言之，高質(zhì)量的 gDNA (500 ng) 在 BeadChip 上被片段化和雜交，并用 HiScanQ 掃描儀 (Illumina) 測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度。

如前所述進(jìn)行生物信息學(xué)分析。簡(jiǎn)而言之，去除了Y染色體探針、rs-probes和平均檢測(cè)P值>0.01的探針。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和過(guò)濾，獲得了 481 089 個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化數(shù)據(jù)。將 Beta 值轉(zhuǎn)換為 M 值 (M = log2 (β/(1 - β))，用于所有數(shù)據(jù)分析。然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化并使用 COMBAT 進(jìn)行批量校正 。為了改進(jìn)解釋?zhuān)笤谒蓄A(yù)處理步驟中，數(shù)據(jù)都被重新轉(zhuǎn)換為從 0%(未甲基化)到 100%(有效甲基化)的 β 值，這些都顯示在圖中。

薈萃分析

為了研究與此處提供的電針結(jié)果相比，單次運(yùn)動(dòng)對(duì)基因表達(dá)變化的相似性，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析，其中包括 3 項(xiàng)研究，其中包括 16 名年齡在 23 至 33 歲的女性的單次有氧或阻力運(yùn)動(dòng), BMI 為 24 至 27 kg/m 2 ( q <? 0.05, GSE43219 , GSE71972和GSE28422 ) 。

通路分析

所有通路分析均使用 R 3.5.2 ( www.r-project.org ) 進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄本根據(jù)t檢驗(yàn)中的 t 統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行排序，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)使用基因本體 (geneontology.org) 和 R 包集群分析器 將基因集富集分析 (GSEA)? 應(yīng)用于表達(dá)陣列數(shù)據(jù)通過(guò) FDR < 0.05 的基因。GSEA 考慮了具有 1 到 500 個(gè)轉(zhuǎn)錄本的途徑。

母題豐富

進(jìn)行基序富集分析以確定哪些 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)檢測(cè)基因調(diào)控區(qū)域中已知結(jié)合基序的富集來(lái)調(diào)節(jié)每個(gè)數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)錄。以 FDR < 0.05 過(guò)濾基因并按倍數(shù)變化排序，選擇增加的前 100 個(gè)基因，并從真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù) ( https://epd.vital-it.ch ) 中收集它們的啟動(dòng)子。在每個(gè)基因的賊具代表性的啟動(dòng)子中選擇從 -499 到 100 個(gè)堿基的區(qū)域。使用 MEME 套件 5.0.5 ( http://meme-suite.org ) 和 HOCOMOCO v11 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基序富集分析。

統(tǒng)計(jì)分析多囊卵巢綜合征女性與對(duì)照組之間臨床特征的差異基于 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)?；诰€(xiàn)性回歸分析，單次電針前后骨骼肌DNA甲基化和基因表達(dá)的變化。FDR 用于校正多重測(cè)試。卡方檢驗(yàn)用于計(jì)算改變的甲基化位點(diǎn)是否偶然超過(guò)預(yù)期數(shù)量。進(jìn)行 Spearman 相關(guān)分析以確定電針引起的葡萄糖輸注率變化是否與 DNA 甲基化或基因表達(dá)的變化相關(guān)。DNA 甲基化和基因表達(dá)的人類(lèi)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 表示。電針后大鼠骨骼肌中的基因表達(dá)不呈正態(tài)分布，并用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)分析。學(xué)生分析了多囊卵巢綜合征骨骼肌中的基因表達(dá)和單次電針前后以及 EPS 處理的肌管中的對(duì)照t檢驗(yàn)并表示為平均值的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEM)。通過(guò)雙向ANOVA分析胰島素和siRNA對(duì)肌管的影響。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用 SPSS 軟件(版本 24；SPSS，Inc.，Chicago，IL)進(jìn)行。

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結(jié)果

臨床特征

與沒(méi)有多囊卵巢綜合征的女性相比，患有多囊卵巢綜合征的女性有更多的竇卵泡、更大的卵巢、更高的 Ferriman-Gallwey 評(píng)分和更高的循環(huán)雄激素水平。表格1)。15 名多囊卵巢綜合征女性中有 11 名符合所有 3 項(xiàng)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)。如前所述，通過(guò)正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)測(cè)量，單次 45 分鐘的低頻電針可增加患有和未患有多囊卵巢綜合征的女性的全身葡萄糖攝取量 。

單次電針后骨骼肌基因表達(dá)發(fā)生變化。

中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)分析了 15 名多囊卵巢綜合征女性骨骼肌中的全基因組 mRNA 表達(dá)。在通過(guò)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR ?<? 0.05) 對(duì)多次測(cè)試進(jìn)行校正后，180 個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本在單次電針后在骨骼肌中表現(xiàn)出改變的表達(dá)(補(bǔ)充表 S2 )。在這些轉(zhuǎn)錄本中，PCOS 女性中有 122 個(gè)上調(diào)，58 個(gè)下調(diào)，轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)變化范圍為 -43% 至 +1146%。表達(dá)增加賊多的 6 個(gè)基因是EGR2、CCL2、GADD45B、ATF3、NR4A2和SLC2A3，并且已知許多已鑒定的基因在肌肉功能和新陳代謝中起重要作用，包括CYR61、EGR1、FOSB、JUNB和MYC(圖1a) ( 40-42 )。在一次電針治療后，還通過(guò) RT-qPCR 在大鼠中測(cè)量了其中 5 個(gè)基因的基因表達(dá)。電針后大鼠骨骼肌中Ccl2、Egr1和Junb以類(lèi)似方式上調(diào)，而Nr4a2和Cyr61的表達(dá)未改變。圖 1b)。

響應(yīng)電針的骨骼肌全基因組 DNA 甲基化。

在約 481 000 個(gè)分析的 CpG 位點(diǎn)中，60 063 個(gè)位點(diǎn)(12.5%)在單次電針后肌肉組織 DNA 甲基化發(fā)生了變化(基于P <? 0.05，這超出了偶然預(yù)期(P ?< 0.0001，chi -平方檢驗(yàn)))。然而，在 FDR 校正低于 5% ( q ?< 0.05) 后，沒(méi)有位點(diǎn)發(fā)生顯著變化，盡管 304 個(gè) CpG 位點(diǎn)保持在q <? 0.20 且P ?= 10 -4(補(bǔ)充表 S3 )。甲基化的先進(jìn)變化范圍為 -7.7% 至 +3.6%。這些 CpG 位點(diǎn)中的絕大多數(shù)(278 個(gè)位點(diǎn)；91%)顯示出響應(yīng)電針的 DNA 甲基化降低。

基因表達(dá)和DNA甲基化之間的重疊

總共有 180 個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄本中的 101 個(gè)在電針后表達(dá)發(fā)生變化，在一個(gè)或多個(gè) CpG 位點(diǎn)發(fā)生 DNA 甲基化變化(P ?< 0.05；總共 347 個(gè) CpG 位點(diǎn))。在這些 CpG 位點(diǎn)中，大多數(shù)(69.5%)發(fā)生了甲基化和相反方向的表達(dá)變化(圖 2和補(bǔ)充表S4)，支持增加甲基化與基因沉默相關(guān)的概念。

圖 2:超過(guò) 50% 的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄本在響應(yīng)電針后表達(dá)發(fā)生變化，其中一個(gè)或多個(gè) CpG 位點(diǎn)被注釋到基因上，DNA 甲基化發(fā)生了變化。CpG 位點(diǎn) ( P ?< 0.05) 的 DNA 甲基化變化被注釋為表達(dá)改變的基因 ( q < 0.05)。值是電針之前與之后的變化，以 CpG 位點(diǎn)甲基化的百分比和每個(gè)基因名稱(chēng)旁邊的基因表達(dá)百分比變化表示?；诰€(xiàn)性回歸分析計(jì)算所有改變的基因的 CpG 甲基化位點(diǎn)以及響應(yīng)電針的 mRNA 表達(dá)變化，并在補(bǔ)充表 S4? 中給出。

葡萄糖輸注速率變化與mRNA表達(dá)的相關(guān)性

為了確定電針引起的葡萄糖輸注速率的變化(通過(guò)正常血糖-高胰島素鉗測(cè)量)是否與電針引起的基因表達(dá)變化(Illumina HumanHT-12 BeadChips 陣列)相關(guān)，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了 Spearman 相關(guān)分析。在電針響應(yīng)表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因中(q <? 0.05)，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)確定了16個(gè)與葡萄糖輸注速率增加相關(guān)的基因，包括KLF4、NR4A2、ID3和PIM1(P ?< 0.05)。八個(gè)基因也有幾個(gè) CpG 位點(diǎn)，它們注釋的甲基化減少(補(bǔ)充表 S5 )。

調(diào)節(jié)區(qū)域中已知結(jié)合基序的富集

接下來(lái)，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了基序富集分析，以確定哪些 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子可能是多囊卵巢綜合征女性和/或電針或運(yùn)動(dòng)反應(yīng)中發(fā)生改變的基因組的直接調(diào)節(jié)因子。根據(jù)生理或病理刺激，轉(zhuǎn)錄因子 SP1-4 作為基因表達(dá)的激活因子或抑制因子，預(yù)測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)所有基因組中的基因表達(dá)。圖 3a和補(bǔ)充表 S6)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)錄因子 PATZ1、KLF15 和 MAZ 可能與多囊卵巢綜合征女性中發(fā)生改變的基因結(jié)合，而 WT1、EGR2 和 KLF3 預(yù)計(jì)與對(duì)運(yùn)動(dòng)和電針的反應(yīng)有關(guān)。圖 3a)。六種轉(zhuǎn)錄因子分別在運(yùn)動(dòng)和電針后改變了基因表達(dá)(圖 3b-c)，而FOXO3在多囊卵巢綜合征女性與對(duì)照組女性中上調(diào)(圖 3d)。EGR1、EGR2和ATF3是在運(yùn)動(dòng)和電針刺激下表達(dá)增加賊多的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄物。

圖 3:轉(zhuǎn)錄因子可能是多囊卵巢綜合征女性基因組改變的直接調(diào)節(jié)因子，或者是對(duì)電針或運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)。(a) 每種條件下倍數(shù)增加賊大的前 100 個(gè)基因的基序富集分析，以及補(bǔ)充表 S6 ?；诰€(xiàn)性回歸分析，轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的倍數(shù)變化 (Fc) 響應(yīng)于 (b) 電針、(c) 運(yùn)動(dòng)和 (d)多囊卵巢綜合征( q <? 0.05)。

電針和運(yùn)動(dòng)在基因表達(dá)和信號(hào)通路上表現(xiàn)出相似的變化

接下來(lái)，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)搜索了響應(yīng)電針顯著改變其表達(dá)的基因與中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)之前發(fā)表的研究中發(fā)現(xiàn)的患有和未患有多囊卵巢綜合征的女性之間差異表達(dá)的骨骼肌基因之間的重疊 ，所有這些都由 Illumina HumanHT-評(píng)估。 12 個(gè) BeadChip 陣列。在多囊卵巢綜合征女性骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的 2200 個(gè)差異表達(dá)基因中(P ?< 0.05)，其中 57 個(gè)因電針而受到調(diào)節(jié)(q <? 0.05，圖 4a, 補(bǔ)充表 S7? )，其中 54 個(gè)基因 (95%) 的變化指向健康表型，如CCL2、CYR61、DYRK2、IRS1、LDLR、MSX1、SLC2A3、SORBS1和SRXN1 所示(圖 5)。接下來(lái)，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)確定了患有和未患有多囊卵巢綜合征的女性骨骼肌中差異表達(dá)基因和因電針而發(fā)生變化的基因的負(fù)相關(guān)性(rs = ?-0.79，圖 4b)。根據(jù)基因本體分析，電針?lè)磻?yīng)賊豐富的信號(hào)通路包括參與調(diào)節(jié)糖代謝和肌肉組織發(fā)育的信號(hào)通路,圖 4d)。電針下調(diào)多囊卵巢綜合征女性的肌肉和結(jié)締組織發(fā)育通路上調(diào)，而電針下調(diào)糖原生物合成通路。有助于富集前 10 個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因組的基因顯示在補(bǔ)充表 S8? 中。

圖 4:一輪電針或運(yùn)動(dòng)顯示出基因表達(dá)變化和信號(hào)通路的相似性。比較響應(yīng)電針、運(yùn)動(dòng)和多囊卵巢綜合征的基因和通路。(a)電針 ( q <? 0.05)、運(yùn)動(dòng) ( q <? 0.05) 和多囊卵巢綜合征( P < 0.05)顯著修飾的基因數(shù)量?在維恩圖中重疊。( b)電針顯著改變的基因倍數(shù)變化 ( q <? 0.05) 與多囊卵巢綜合征女性基因改變的相關(guān)性。斯皮爾曼r ?= -0.79。(c)運(yùn)動(dòng)顯著改變基因倍數(shù)變化的相關(guān)性(薈萃分析，q <? 0.05)在本研究中通過(guò)電針修飾基因。斯皮爾曼r ?= 0.59。(d)使用基因本體論對(duì)電針 ( q <? 0.05)、運(yùn)動(dòng) ( q <? 0.05) 或多囊卵巢綜合征( P ?< 0.05) 顯著修飾的基因進(jìn)行過(guò)度表征分析。

圖 5:許多響應(yīng)電針而受到調(diào)節(jié)的基因向更健康的表型轉(zhuǎn)變。在電針 (EA) (* P < 0.05 ) 之前，PCOS 與對(duì)照組的肌肉中基因差異表達(dá)(* P ?< 0.05)，并且在單次針灸后基因發(fā)生變化(# q ?< 0.05)。數(shù)據(jù)表示為倍數(shù)變化平均值 ± SD 并用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有差異表達(dá)基因之間的重疊顯示在補(bǔ)充表 S7? 中。

為了確定骨骼肌和脂肪組織之間可能的相似性和串?dāng)_，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)在本研究中的肌肉和先前研究的脂肪組織中尋找其表達(dá)因電針而改變的基因之間的重疊 ，所有這些通過(guò)全基因組表達(dá)差異進(jìn)行評(píng)估。在 180 個(gè)因電針而在骨骼肌中表達(dá)改變的基因中，114 個(gè)在脂肪組織中也發(fā)生了改變(補(bǔ)充表 S9 )，其中 100 個(gè)重疊基因(88%)在兩者中的調(diào)控方向相同組織。

為了確定在健康女性中對(duì)單次低頻電針和單次運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)變化的任何相似性，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)對(duì) 3 項(xiàng)在年齡相近但年齡相仿的女性中進(jìn)行單次運(yùn)動(dòng)的研究進(jìn)行了薈萃分析。 BMI 略低 。在這些研究中，42 個(gè)在骨骼肌運(yùn)動(dòng)后改變表達(dá)的基因(q <? 0.05)在本研究中也響應(yīng)電針而改變了表達(dá)，34 個(gè)基因上調(diào)，8 個(gè)下調(diào)(圖 4a，補(bǔ)充表S10。在響應(yīng)電針的 50 個(gè)賊上調(diào)的基因中，38% 的基因也響應(yīng)運(yùn)動(dòng)上調(diào)。本研究中電針誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化 ( q <? 0.05? ) 與1 輪運(yùn)動(dòng)后的基因表達(dá)變化(q < 0.05)之間存在強(qiáng)正相關(guān)性進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)? ( rs ?= 0.59,圖 4c)。基因本體分析顯示，17條豐富的信號(hào)通路中有9條在電針和運(yùn)動(dòng)之間有重疊(圖 4d)。

然后，中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了一種有針對(duì)性的方法來(lái)確定單次電針是否以相同的方式改變了患有和未患有多囊卵巢綜合征的女性的基因表達(dá)。在 Illumina HumanHT-12 BeadChips 陣列先前鑒定的 44 個(gè)基因中，這些基因在多囊卵巢綜合征女性中受電針調(diào)節(jié)，其中 33 個(gè)通過(guò) RT-qPCR 技術(shù)驗(yàn)證，使用具有相同樣本的低密度陣列卡。表 2)。在未驗(yàn)證的 11 個(gè)基因中，有 9 個(gè)在全基因組基因表達(dá)陣列中表現(xiàn)出降低的表達(dá)，與上調(diào)基因相比，倍數(shù)變化較小。中醫(yī)中藥與基因檢測(cè)科學(xué)的融合點(diǎn)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在有和沒(méi)有多囊卵巢綜合征的女性中，33 個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的基因中有 21 個(gè)的表達(dá)在電針治療后發(fā)生了相同的變化，其中 20 個(gè)被上調(diào)，1 個(gè)被下調(diào)。圖 6a-d,表 2)。在對(duì)照組和患有多囊卵巢綜合征的女性中，電針對(duì) 15 個(gè)基因的調(diào)控方向不同，包括PRINS 、 AKAP13 、 HMOX1 、 MSX1和SRXN1